محیط انتقال ویروس (VTM): اصول، آماده‌سازی، کاربرد و محدودیت

فهرست مطالب نمایش

تعریف محیط انتقال ویروس (VTM)

محیط انتقال ویروس (VTM) یک ماده مغذی است که برای حمل و حفظ قابلیت زنده ماندن نمونه‌ها (ویروس‌ها) به آزمایشگاه جهت شناسایی و پردازش بیشتر نمونه استفاده می‌شود.

محیط‌های انتقال برای ویروس‌ها به طور ویژه‌ای مهم هستند زیرا نسبت به سایر عوامل عفونی حساس‌تر می‌باشند.
احتمال جداسازی موفقیت‌آمیز زمانی افزایش می‌یابد که فاصله زمانی بین جمع آوری و تلقیح کشت کمتر باشد و نمونه حاوی ذرات هر چه بیشتر ویروس باشد.
به منظور به حداکثر رساندن میزان ویروس در نمونه، جمع آوری نمونه باید در اوایل بیماری شخص انجام شود.
جداسازی موفقیت‌آمیز و مطمئن ویروس‌ها زمانی انجام می‌شود که از یک محیط انتقال مناسب استفاده شود.
هنگامی که نمونه‌های ویروسی به یک آزمایشگاه محلی یا یک آزمایشگاه مرجع ارسال شوند، میزان جداسازی افزایش می‌یابد.

اصول محیط انتقال ویروس (VTM)

عوامل ویروسی از نظر ترکیب، پایداری، ساختار، مورفولوژی و اندازه بسیار متفاوت هستند. ویروس‌های انباشت آزاد پوشش‌دار که از نمونه‌های انسانی به دست می‌آیند، عموماً نسبت به ویروس‌های متراکم بدون پوشش، حساس‌تر هستند.
از آن‌جایی که این ویروس‌ها نسبت به شرایط محیطی حساس هستند، باید با استفاده از محلول‌های مختلفی از قابلیت زنده ماندن این ویروس‌ها محافظت کرد.
برخی از ویروس‌های پوشش‌دار، مانند ویروس‌های هرپس سیمپلکس (Herpes simplex viruses (HSV))، هنگامی که در یک محیط نگه‌داری مناسب قرار می‌گیرند، به طرز شگفت‌آوری در حالت غیر منجمد پایدار هستند. با این حال، بیشتر ویروس‌ها به دمای سردتر نیاز دارند.
عفونت‌زایی ویروس‌ها با گذشت زمان کاهش می‌یابد و به طور کلی، میزان از بین رفتن ویروس‌ها تابعی از دما است، به طوری که با سرد کردن پایداری افزایش می‌یابد.
بنابراین محیط‌های انتقال ویروس با ایده فراهم کردن شرایط مناسب دمایی، pH و مواد مغذی تهیه می‌شوند.
اجزاء یک محیط انتقال ویروس مناسب برای ایجاد یک محلول ایزوتونیک (Isotonic) شامل پروتئین‌هایی برای محافظت از ساختار ویروسی، آنتی‌بیوتیک برای کنترل آلودگی میکروبی و یک یا چند بافر برای کنترل pH می‌باشند.
محیط‌های انتقال ویروس با ایده حفظ قابلیت زنده ماندن کشت ویروسی یا نمونه‌ها برای انجام آزمایش‌هایی مانند تست تقویت اسید نوکلئیک (Nucleic acid amplification test (NAAT)) و در عین حال جلوگیری از خشک شدن نمونه تهیه می‌شوند.

ترکیبات محیط انتقال ویروس (VTM)

یک محیط انتقال ویروس ایده‌آل دارای بسیاری از ویژگی‌های زیر است:

این محیط می‌تواند فعالیت ویروس را حتی در دمای اتاق حفظ کند.
این محیط برای کشت سلولی غیرسمی است و ظهور اثرات سیتوپاتیک ویروسی را تحت شعاع قرار نمی‌دهد.
ماندگاری طولانی خواهد داشت (چه در حالت منجمد و چه در حالت غیرمنجمد).
این محیط می‌تواند هم برای جداسازی‌های کشت و هم برای انجام آزمایش‌های مستقیم مانند ایمونواسی آنزیمی (Enzyme immunoassay) یا ایمونوفلورسانس (Immunofluorescence)، مناسب باشد.

به منظور دستیابی به تمام ویژگی‌های ذکر شده در بالا، محیط‌های انتقال ویروس معمولا دارای یک جزء پروتئینی محافظ، عوامل ضد میکروبی برای جلوگیری از احتمال آلودگی و بافرهایی برای حفظ pH محلول هستند.
برخی از VTMها همچنین دارای یون‌ها و مواد معدنی اضافی هستند که به حفظ زنده مانی چنین نمونه‌هایی کمک می‌کند.

آماده‌سازی محیط انتقال ویروس (VTM)

تعدادی از محیط‌های انتقال ویروس به صورت تجاری در دسترس هستند و می‌توان آن‌ها را مستقیماً با شرایط ذکر شده خریداری و استفاده کرد.
برخی از این محیط‌ها عبارتند از: COPAN Universal Transport Media و Eagle Minimum Essential Media (EMEM).
با این حال برخی از محیط‌های دیگر را می‌توان با حفظ شرایط و ترکیب مناسب، در محل تهیه کرد.
ترکیب و آماده‌سازی محیط‌های انتقال ویروس مختلف بسته به این‌که نمونه از انسان یا حیوانات گرفته شده است، متفاوت می‌باشد.

برای نمونه‌برداری از انسان

در زیر روش آماده‌سازی VTMهایی که در محل برای سواب (Swab) بینی و گلو از انسان ساخته می‌شوند، آورده شده است:

10 گرم اینفیوژن براث (Infusion broth) و 2 گرم آلبومین گاوی کسر پنجم (Bovine albumin fraction V) را به آب مقطر استریل (به 400 میلی‌لیتر) اضافه کنید.
8 میلی‌لیتر محلول سولفات جنتامایسین (Gentamicin sulfate) (50 میلی‌گرم در میلی‌لیتر) و 3.2 میلی‌لیتر آمفوتریسین B (Amphotericin B) (250 میکروگرم در میلی‌لیتر) اضافه کنید.
با فیلتراسیون محلول را استریل کنید.

در زیر روش دقیق‌تری جهت آماده‌سازی حجم بیشتری از VTM برای انسان آورده شده است:

500 میلی‌لیتر سرم جنین گاوی (Fetal bovine serum (FBS)) را با حرارت دادن به مدت 30 دقیقه در بن‌ماری (Water bath) در دمای 1 ± 56 درجه سانتی‌گراد غیرفعال کنید. در صورت امکان از FBS غیرفعال تجاری استفاده کنید.
50 میلی‌لیتر آمفوتریسین B (Amphotericin B) و سپس 50 میلی‌لیتر جنتامایسین (Gentamicin) را به FBS غیرفعال اضافه کنید و سپس محلول را از طریق یک واحد فیلتر 0.20 تا 0.45 میکرومتری (واحد فیلتر 150 میلی‌لیتری) استریل کنید.
10 میلی‌لیتر از FBS را به 500 میلی‌لیتر محلول نمکی متعادل هنکس (Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)) اضافه کنید.
2 میلی‌لیتر از مخلوط جنتامایسین/آمفوتریسین B را به HBSS مخلوط شده با FBS اضافه کنید.
محلول‌ها را در بطری‌هایی توزیع کنید. با برعکس کردن بطری آن را مخلوط کنید.
روی بطری را به همراه تاریخ تولید، مواد افزودنی و تاریخ انقضا برچسب بزنید.
3 میلی‌لیتر از محیط را در لوله‌های مخروطی با درب‌پوش پیچی استریل جداگانه (مانند لوله‌های 100×16 میلی‌متر) بریزید. پس از توزیع مواد، درب‌ها را محکم ببندید. ظروف را با اطلاعات لازم برچسب بزنید.
در دمای 2 تا 8 درجه سانتی‌گراد نگه‌داری کنید.

برای نمونه‌برداری از حیوانات

برای جمع آوری و انتقال نمونه‌ها در حیوانات می‌توان از دو نوع VTM استفاده کرد.
محیط انتقال 199 به طور گسترده برای جمع آوری و انتقال نمونه‌های بالینی از همه گونه‌ها استفاده می‌شود.
یک محیط دوم به نام محیط انتقال PBS-Glycerol، که محیط مبتنی بر گلیسرول است، پایداری طولانی‌مدت نمونه‌ها را در جایی که خنک‌سازی فوری امکان‌پذیر نیست، فراهم می‌کند.
این محیط برای تلقیح تخم مناسب است اما برای تلقیح کشت بافت مناسب نیست.

آماده‌سازی محیط انتقال 199

یک محیط کشت بافت 199 حاوی 0.5٪ آلبومین سرم گاوی (Bovine serum albumin (BSA)) را بردارید.
به 1 لیتر از محیط فوق مواد ذیل را اضافه کنید:

بنزیل‌پنی‌سیلین (Benzylpenicillin) (2 × 106 IU در لیتر)، استرپتومایسین (200 میلی گرم در لیتر)، پلی میکسین B (10⁶ × 2 IU در لیتر)، جنتامایسین (250 میلی‌گرم در لیتر)، نیستاتین (Nystatin) (10⁶ × 0.5 IU در لیتر)، افلوکساسین هیدروکلراید (Ofloxacin hydrochloride) (60 میلی‌گرم در لیتر)، و سولفامتوکسازول (Sulfamethoxazole) (0.2 گرم در لیتر).

مخلوط فوق را با فیلتراسیون، استریل کنید و در حجم‌های 1 تا 2 میلی‌لیتری در لوله‌های درپوش پیچی توزیع کنید.

آماده‌سازی محیط انتقال PBS-گلیسرول

با افزودن 8 گرم NaCl، 0.2 گرم KCl، 1.44 گرم Na2HPO4، و 0.24 گرم KH2PO4، نمک بافر فسفات (Phosphate-buffer saline) را آماده کنید. آب مقطر را به این مخلوط اضافه کنید تا حجم آن به 1 لیتر برسد.
مخلوط آماده شده را اتوکلاو کرده و به نسبت 1 به 1 با گلیسرول استریل مخلوط کنید تا 1 لیتر شود.
به 1 لیتر از مخلوط فوق موارد ذیل را اضافه کنید:

بنزیل‌پنی‌سیلین (10⁶ × 2 IU در لیتر)، استرپتومایسین (200 میلی‌گرم در لیتر)، پلی‌میکسین B (Polymyxin B) (10⁶ × 2 IU در لیتر)، جنتامایسین (250 میلی‌گرم در لیتر)، نیستاتین (10⁶ × 0.5 IU در لیتر)، افلوکساسین هیدروکلراید (60 میلی‌گرم در لیتر)، و سولفامتوکسازول (0.2 گرم در لیتر).

1 تا 2 میلی‌لیتر از محیط انتقال را در ویال‌های پلاستیکی استریل درپوش پیچی بریزید.
این ویال‌ها را تا زمان استفاده در دمای 20- درجه سانتی‌گراد یا به مدت کوتاه 1 تا 2 روز در دمای اتاق نگه‌داری کنید.

موارد استفاده از محیط انتقال ویروس (VTM)

از محیط‌های انتقال ویروس برای جمع آوری و انتقال نمونه‌های حاوی ویروس استفاده می‌شود.
این محیط‌ها همچنین برای حفظ قابلیت زیست ارگانیسم‌های دیگر مانند مایکوپلاسما (Mycoplasma)، کلامیدیا (Chlamydiae) و اورهاپلاسما (Ureaplasma) استفاده می‌شوند.
VTMها همچنین به ماکسیمم‌سازی تعداد ذرات ویروسی در یک نمونه کمک می‌کنند.
محیط‌های انتقال مایع عمدتاً برای انتقال سواب‌ها یا موادی که از سواب جمع آوری در محیط آزاد می‌شوند، استفاده می‌گردند.
جمع آوری و انتقال نمونه‌ها را در مناطقی که امکانات سرد‌سازی در دسترس نیست، تسهیل می‌کنند.

محدودیت‌های محیط انتقال ویروس (VTM)

ممکن است رشد برخی آلاینده‌ها در طول دوره طولانی انتقال مشاهده شود.
پس از انتقال، نمونه باید در اسرع وقت در محیط مناسب تلقیح شود. برای رسیدن به نتایج بهینه، فاصله زمانی بین جمع‌آوری نمونه و تلقیح بر روی محیط کشت باید به حداقل برسد.
برخی از ویروس‌ها ممکن است نسبت به سایرین حساس‌تر باشند و VTM‌ها نیز ممکن است به همان اندازه موثر باشند.
برخی از آنتی‌بیوتیک‌ها و مواد شیمیایی مورد استفاده در VTMها ممکن است pH محلول را تغییر دهند که بر زیست‌پذیری ارگانیسم تأثیر می‌گذارند.

همچنین بخوانید: