محیط کشت لوفلر: ترکیب، اصول، آماده‌سازی، نتایج و کاربرد

فهرست مطالب نمایش

مقدمه‌ای بر محیط کشت لوفلر

محیط کشت لوفلر اصلاحی بر روی فرمول اصلی محیطی است که توسط Loeffler در سال 1887 ابداع شد. محیط کشت لوفلر جداسازی اولیه و ثانویه و کشت میکروارگانیسم‌های بیماری‌زای سخت‌پسند (Fastidious)، به ویژه از بینی و گلو را بهبود می‌بخشد. همچنین پس از از بین رفتن آن‌ها به دلیل انکوباسیون طولانی مدت یا پاساژ مکرر، بیماری‌زایی و سایر خواص شناسایی (میکروسکوپی و کلونی) را بازیابی می‌کند. محتوای بالای سرم به تعیین فعالیت پروتئولیتیک ارگانیسم‌ها کمک می‌کند. همچنین برای نمایش رنگدانه‌ها و آسکوسپورها استفاده می‌شود.

ترکیبات محیط کشت لوفلر

اجزای تشکیل دهنده	گرم در لیتر
پروتئوز پپتون (Proteose Peptone)	2.5 گرم
دکستروز (Dextrose)	2.5 گرم
کلرید سدیم	1.25 گرم
عصاره گوشت گاو	2.5 گرم
سرم اسب	750 میلی‌لیتر

pH نهایی (در دمای 25 درجه سانتی‌گراد): 0.3 ± 7.6

اصول محیط کشت لوفلر

این محیط حاوی سرم اسب، عصاره گوشت گاو، دکستروز و پپتون‌های پروتئوزی است که با هم مواد نیتروژن‌دار پیچیده و مواد مغذی لازم برای تقویت رشد کورینه‌باکتریوم دیفتری (Corynebacterium diphtheriae) را تامین می‌کنند. کلرید سدیم برای تامین یون‌های ضروری اضافه شده است.

دکستروز منبع کربوهیدرات‌های قابل تخمیر است. سرم باعث سفت شدن محیط در طی فرآیند استرلیزه کردن شده و منبع پروتئینی است که در متابولیسم کورینه باکتری‌ها و سایر ارگانیسم‌ها استفاده می‌شود. این محیط رشد گرانول‌های متاکروماتیک (Metachromatic granule) را که با رنگ‌آمیزی به وسیله متیلن بلو (Methylene blue) دیده می‌شود، تقویت می‌کند. تشکیل گرانول‌ها، مورفولوژی سلولی خاص کورینه‌باکتریوم دیفتری را نشان می‌دهد.

آماده‌سازی و روش استفاده از محیط کشت لوفلر

75 گرم را از محیط را در 250 میلی‌لیتر آب مقطر بریزید.
محیط را کاملاً حل کرده و با اتوکلاو کردن با فشار 10 پوند (115 درجه سانتی‌گراد) به مدت 20 دقیقه استریل کنید.
محیط را تا دمای 50 تا 55 درجه سانتی‌گراد خنک کرده و 750 میلی‌لیتر سرم اسب استریل به صورت آسپتیک (Aseptic) به آن اضافه کنید.
آن را خوب مخلوط کرده و به صورت آسپتیک در لوله‎های آزمایشی استریل بریزید.
محیط را با غلیظ کردن آن از طریق یک جریان بخار با دمای 80 تا 85 درجه سانتی‌گراد به مدت 2 ساعت در حداقل 3 روز متوالی، استریل کنید.
قبل از تلقیح اجازه دهید محیط تا دمای اتاق خنک شود.
با حرکت دادن سواب نمونه به چپ و راست (Fishtail motion) روی محیط، آن را به طور مستقیم تلقیح کنید.
محیط را در دمای 35 درجه سانتی‎گراد تا 4 روز به صورت هوازی انکوبه کنید.
روزانه محیط را از نظر مورفولوژی کلنی نوعی بررسی کنید.
برای بررسی وجود گرانول‌های متاکروماتیک، در یک مقاله چینی مربوط به شکل سلول‌ها پیشنهاد شده که رنگ‌آمیزی با متیلن بلو را انجام دهید.
شناسایی قطعی کورینه‌باکتریوم دیفتری با انجام تست‌های بیوشیمیایی و سم‌زایی انجام می‌شود.

برای تشخیص پروتئولیز (Proteolysis) میکروارگانیسم‌های هوازی

محیط را با کلنی‌های ایزوله شده ارگانیسم مورد نظر، تلقیح کنید.
آن را در دمای 35 درجه سانتی‌گراد به مدت 3 تا 4 روز به صورت هوازی انکوبه کنید.
مورفولوژی کلنی نوعی را بررسی کنید.

برای تشخیص پروتئولیز میکروارگانیسم‌های بی‌هوازی

محیط را با کلنی‌های ایزوله شده ارگانیسم مورد نظر، تلقیح کنید.
محیط را به صورت بی‌هوازی در دمای 35 درجه سانتی‌گراد به مدت 3 تا 4 روز انکوبه کنید. یا درست قبل از انکوباسیون، محیط شیب‌دار تلقیح شده را با براث تیوگلیکولات (Thioglycollate Broth) پوشانده، درپوش را محکم کرده و به صورت هوازی انکوبه کنید.
مورفولوژی کلنی نوعی را بررسی کنید.

تفسیر نتایج در محیط کشت لوفلر

رشد گونه‌های کورینه‌باکتریوم در محیط کشت لوفلر: گونه‌های کورینه‌باکتریوم گرانول‌ها و ظاهر متاکروماتیک در رنگ‌آمیزی با متیلن بلو را نشان می‌دهند (پیشنهادی در یک مقاله چینی).
پروتئولیز توسط شکل ظاهری کلنی‌هایی که توسط یک چاله کوچک از محیط مایع احاطه شده و یا مایع شدن محیط شیب‌دار با تولید بوی گندیده، مشخص می‌شود.

ارگانیسم		رشد
کورینه‌باکتریوم دیفتری	رشد ارگانیسم؛ کلنی‌های ریز و کرم رنگ با مرکز کمی برجسته. گرانول‌های متاکروماتیک که در رنگ‌آمیزی با متیلن بلو دیده می‌شوند
کورینه‌باکتریوم سودودیپ‌تریتیکوم (Corynebacterium pseudodiptheriticum)	رشد ارگانیسم؛ کلنی‌های ریز و کرم رنگ
سودوموناس آئروژینوزا (Pseudomonas aeruginosa)	رشد خوب؛ کلنی‌های سبز با پروتئولیز
استافیلوکوکوس اورئوس (Staphylococcus aureus)	رشد خوب؛ کلنی‌های زرد تا طلایی
استرپتوکوک پیوژنز (Streptococcus pyogenes)	رشد مناسب تا خوب؛ غیر پروتئولیتیک

موارد استفاده از محیط کشت لوفلر

مزیت اولیه محیط کشت لوفلر در رشد و توصیف خصوصیات مورفولوژیکی اعضای دسته کورینه‌باکتریوم است. این فرمول باعث افزایش تشکیل گرانول‌های متاکروماتیک در سلول‌های ارگانیسم‌ها می‌شود.
با توجه به محتوای سرمی، محیط کشت لوفلر می‌تواند برای تعیین فعالیت‌های پروتئولیتیک میکروارگانیسم‌ها استفاده شود.
سطح خاکستری مایل به سفید محیط، زمینه‌ای عالی برای تشخیص و مشاهده رنگدانه‌های کلنی‌ها فراهم می‌کند.
اگر تمام رطوبت اضافی محیط شیب‌دار به صورت آسپتیک خارج و قسمت بالای محیط شیب‌دار تا زمانی که دچار گسستگی شود، گرم کنیم، می‌توان از این محیط برای شناسایی آسکوسپورها استفاده کرد.

محدودیت‌های محیط کشت لوفلر

توصیه می‌شود برای شناسایی کامل، آزمایش بیوشیمیایی، ایمونولوژیک، مولکولی یا طیف‌سنجی جرمی روی کلنی‌های حاصل از کشت خالص انجام شود.
توصیه می‌شود که محیط‌های انتخابی و غیرانتخابی به موازات محیط کشت لوفلر برای جداسازی کورینه‌باکتریوم دیفتری، تلقیح شوند. پتاسیم تلوریت سیستین آگار (Potassium Tellurite Cystine Agar) و بلاد آگار برای افزایش بازیابی ارگانیسم توصیه می‌شود.
برای بهینه‌سازی بازیابی کورینه‌باکتریوم دیفتری، یک نمونه از نازوفارنکس (Nasopharyngeal) و گلو باید در طی عمل جمع آوری نمونه، تهیه شود.
تنوع در مورفولوژی میکروسکوپی ممکن است از یک قسمت تا قسمت دیگر از محیط کشت لوفلر، متفاوت باشد.
میکروارگانیسم‌های گرم مثبت غیر از کورینه باکتریوم ممکن است هنگامی که در محیط لوفلر رشد می‌کنند، گرانول‌های متاکروماتیک تولید کنند.
تشخیص پروتئولیز توسط برخی از میکروارگانیسم‌ها ممکن است به دوره‌های انکوباسیون بیش از چهار روزی که توصیه شده، نیاز داشته باشد.

همچنین بخوانید: