محیط کشت CIN یا یرسینیا: اصول، ترکیب، روش آماده‌سازی و موارد استفاده

محیط کشت CIN یا یرسینیا چیست؟

سفسولودین- ایرگاسان- نووبیوسین آگار (Cefsulodin-Irgasan-Novobiocin Agar (CIN Agar)) که با نام آگار انتخابی یرسینیا (Yersinia Selective Agar) نیز شناخته می‌شود، یک محیط کشت انتخابی و افتراقی است که برای جداسازی و شناسایی انتخابی گونه‌های یرسینیا، به ویژه سویه‌های یرسینیا انتروکولیتیکا (Yersinia enterocolitica) استفاده می‌شود.

این محیط برای اولین بار توسط Schiemann D.A. فرموله و توصیف شد. در سال 1979. محیط کشت CIN که توسط Schiemann معرفی شد، حاوی سفسولودین، ایرگاسان، نووبیوسین، کریستال ویولت (Crystal violet) و نمک‌های صفراوی به عنوان اجزای اصلی انتخابی علاوه بر سایر منابع مغذی بود. بعداً چند جزء اصلاح و مقادیر برای افزایش کارایی محیط، تنظیم شدند. (ترکیب اصلی محیط کشت CIN در ادامه توضیح داده خواهد شد.)

هدف محیط کشت یرسینیا

هدف محیط کشت CIN برای جداسازی و شناسایی انتخابی سویه‌های یرسینیا انتروکولیتیکا از نمونه‌های مدفوع (نمونه‌های بالینی) و نمونه‌های غذا.

اصول محیط کشت CIN

محیط کشت CIN حاوی اجزا و آنتی‌بیوتیک‌های مهارکننده مختلفی است که رشد باکتری‌های گرم مثبت و بسیاری از باکتری‌های گرم منفی را سرکوب می‌کند. علاوه بر این، وجود یک اندیکاتور امکان شناسایی احتمالی کلنی‌های یرسینیا انتروکولیتیکا را فراهم می‌کند.

کریستال ویولت و سدیم دئوکسی‌کولات (Sodium deoxycholate) (نمک صفراوی) موجود در محیط رشد باکتری‌های گرم مثبت را سرکوب می‌کنند. ایرگاسان سرکوب رشد باکتری‌ها و قارچ‌های گرم مثبت را بیشتر افزایش می‌دهد. ترکیب آنتی‌بیوتیک‌هایی مانند سفسولودین، ایرگاسان و نووبیوسین رشد بسیاری از باکتری‌های گرم منفی و گرم مثبت به جز یرسینیا انتروکولیتیکا و تعدادی از باکتری‌های دیگر را سرکوب می‌کند و به طور انتخابی به یرسینیا انتروکولیتیکا اجازه می‌دهد تا نسبت به سایر رقبا، بیشتر رشد کند.

لاکتوز (Lactose) موجود در محیط به آسانی توسط گونه‌های یرسینیا قابل تخمیر بوده و اسیدهای آلی را به عنوان یک محصول جانبی تولید می‌کند. این اسیدهای تولید شده، PH محیط را کاهش می‌دهند که توسط نوترال رد (Neutral red) موجود در محیط به عنوان اندیکاتور pH، شناسایی می‌شود. سویه‌های یرسینیا انتروکولیتیکا قادر به تخمیر لاکتوز و تولید اسید هستند. از این رو، آن‌ها کلنی‌های “چشم گاو مانند” (Bull’s-eye) مشخصی را تولید می‌کنند. یعنی کلنی‌ها حاوی یک ناحیه مرکزی قرمز/ صورتی تیره که توسط یک ناحیه نیمه شفاف بیرونی احاطه شده است، می‌باشند.

ترکیبات محیط کشت CIN

ترکیب آگار CIN توصیف شده توسط Schiemann D.A در زیر آمده است:

اجزاء و مقدار آن‌ها

• پپتون ویژه (Special Peptone) (اکسوئید (Oxoid)): 20 گرم
• عصاره مخمر (دیفکو (Difco)): 2 گرم
• مانیتول (Mannitol): 20 گرم
• اسید پیروویک (Pyruvic Acid) (نمک سدیم): 2 گرم
• کلرید سدیم (Sodium Chloride): 1 گرم
• سولفات منیزیم.7H2O: 10 میلی‌گرم (10 میلی‌لیتر محلول ذخیره 0.1٪)
• آگار (اکسوئید شماره 4): 12 گرم
• ایرگاسان DP300:  10 میلی‌لیتر از محلول 0.04 درصد در اتانول 95 درصد
• نمک‌های صفراوی (دیفکو): 2 گرم در 200 میلی‌لیتر آب مقطر
• NaOH: 1 میلی‌لیتر محلول  5N NaOH
• نوترال رد: 10 میلی‌لیتر از محلول 3 میلی‌گرم در میلی‌لیتر
• کریستال ویولت: 10 میلی‌لیتر از محلول 0.1 میلی‌گرم در میلی‌لیتر
• سفسولودین: 10 میلی‌لیتر از محلول 1.5 میلی‌گرم در میلی‌لیتر
• نووبیوسین: 10 میلی‌لیتر از محلول 1.5 میلی‌گرم در میلی‌لیتر
• pH نهایی (تنظیم شده توسط 5N NaOH): 7.4

ترکیب جدید و در حال استفاده طبق HiMedia

این شرکت اکثرا محیط کشت CIN را به عنوان پایه آگار CIN و مواد مکمل عرضه می‌کند. پایه آگار شامل تمام اجزاء به جز اجزای ضد میکروبی می‌باشد. به عبارتی سفسولودین، ایرگاسان و نووبیوسین به صورت جداگانه به عنوان مکمل‌های انتخابی عرضه می‌شوند، زیرا نمی‌توانند مانند سایر اجزاء اتوکلاو شوند.

آزمایشگاه‌های HiMedia نیز به این روش عرضه می‌کنند. آن‌ها یک پایه آگار CIN به نام پایه آگار یرسینیا و مکمل انتخابی CTN ارائه می‌دهند. مخلوط کردن این دو محصول به نسبت صحیح، آگار CIN را برای جداسازی انتخابی یرسینیا انتروکولیتیکا شکل می‌دهد.

اجزای محیط کشت CIN در 1000 میلی‌لیتر

• پپتون: 20 گرم
• عصاره مخمر: 2 گرم
• مانیتول: 20 گرم
• سدیم پیروات (Sodium pyruvate): 2 گرم
• کلرید سدیم(NaCl): 1 گرم
• سولفات منیزیم: 0.01 گرم
• سدیم دئوکسی‌کولات: 0.5 گرم
• نوترال رد: 0.03 گرم
• کریستال ویولت: 0.001 گرم
• مکمل انتخابی CTN (FD034): 2 ویال
• آگار: 12.5 گرم
• pH نهایی در دمای 25 درجه سانتی‌گراد: 0.2 ± 7.4

اجزای هر 1 ویال مکمل انتخابی CTN (FD034)

• سفسولودین: 7.5 میلی گرم
• ایرگاسان (تریکلوزان (Triclosan)): 2 میلی‌گرم
• نووبیوسین: 1.25 میلی‌گرم

آماده‌سازی محیط کشت CIN از HiMedia

1. 04 گرم از محیط پایه یرسینیا آگار (یا مقدار لازم از هر جزء ذکر شده در بالا) را در 1000 میلی‌لیتر آب مقطر در یک ارلن مایر (Conical flask) یا بطری شیشه‌ای مناسب بریزید.
2. آن را با استفاده از یک همزن مغناطیسی (Magnetic stirrer) یا تکان دادن دستی، خوب حل کنید.
3. حرارت دهید تا به جوش آید تا هر جزء از جمله آگار به طور کامل در آب حل شود.
4. محیط را به مدت 15 دقیقه در دمای 121 درجه سانتی‌گراد و فشار 15 پوند اتوکلاو کنید تا محیط استریل شود.
5. اجازه دهید محیط تا حدود 45 درجه سانتی‌گراد خنک شود.
6. 2 میلی‌لیتر آب مقطر استریل و 1 میلی‌لیتر اتانول را به ویال مکمل انتخابی CTN (FD034) اضافه کنید و با تکان دادن آرام ویال، اجزا را مخلوط کنید. 2 ویال با این روش آماده کنید.
7. هنگامی که محیط پایه تا حدود 45 درجه سانتی‌گراد خنک شد، 2 ویال آماده شده از مکمل انتخابی CTN را در محیط پایه مخلوط کنید.
8. با تکان دادن ملایم خوب مخلوط کنید. این پروسه، محیط کشت CIN قابل استفاده را تشکیل می‌دهد.
9. حجم مورد نیاز محیط کشت CIN را در یک پلیت پتری (Petri plate) یا لوله آزمایش بریزید و اجازه دهید قبل از استفاده کاملاً جامد شود.

ماندگاری و شرایط نگهداری

• در دمای 2 تا 8 درجه سانتی‌گراد و در شرایط دربسته، محیط آماده شده را می‌توان حدود 3 تا 8 هفته نگه‌داری کرد. اجزای محیط آماده نشده را می‌توان در دمای 10 تا 30 درجه سانتی‌گراد در ظرف دربسته تا تاریخ انقضای روی برچسب نگه‌داری کرد.

کنترل کیفیت و خصوصیات کلنی در آگار CIN

• پودر محیط آماده نشده با اندیکاتور نوترال رد به صورت پودر زرد تا صورتی رنگی به نظر می‌رسد. در حالی که محیط آماده شده و جامد شده در پلیت پتری به رنگ نارنجی-قرمز/ صورتی به نظر می‌رسد.
• pH محیط باید در دمای 25 درجه سانتی‌گراد برابر 0.2 ±4 باشد.
• خصوصیات کشت برخی از باکتری‌ها پس از 24 تا 48 ساعت انکوباسیون در دمای 22 تا 32 درجه سانتی‌گراد:

موارد احتیاط

• قبل از اتوکلاو یا زمانی که محیط بالای 50 درجه سانتی‌گراد یا کمتر از 40 درجه سانتی‌گراد است، مکمل انتخابی CTN را اضافه نکنید.
• از آب مقطر استریل برای هیدراته کردن ویال مکمل انتخابی CTN استفاده کنید.
• از مقدار مناسب مکمل انتخابی CTN استفاده کنید، در غیر این صورت باکتری‌های دیگر نیز می‌توانند رشد کنند.

محدودیت‌های محیط کشت CIN

• سایر گونه‌های یرسینیا مانند یرسینیا پسودوتوبرکلوزیس ( pseudotuberculosis)، یرسینیا فردریکسنی (Yersinia frederiksenii)، یرسینیا کریستنسنی (Y. kristensenii)، یرسینیا اینترمدیا (Y. intermedia) و غیره نیز می‌توانند رشد کنند و کلنی‌های مشابهی تولید کنند.
• آئروموناس (Aeromonas)، سراشیا ﻟﯿﮑﻮﻓﺎﺳﯿﻨﺲ (Serratia Liquefaciens)، سیتروباکتر فروندی (Citrobacter freundi) و انتروباکتر آگلومرانس (Enterobacter agglomerans) نیز در این محیط رشد می‌کنند و ویژگی‌های کلنی مشابهی را نشان می‌دهند.
• این محیط فقط به صورت احتمالی کار شناسایی را انجام می‌دهد. شناسایی یرسینیا انتروکولیتیکا باید با استفاده از آنالیز بیوشیمیایی یا ژنتیکی تایید شود.

کاربردها

• جداسازی و شناسایی سویه‌های یرسینیا انتروکولیتیکا از نمونه‌های بالینی (مدفوع) و نمونه‌های غذایی.

ایمنی و دفع

• محیط مورد استفاده را پس از اتوکلاو یا سوزاندن دور بریزید.

همچنین بخوانید:

• محیط کشت لوینتال: ترکیب، اصول، روش آماده‌سازی، نتایج و موارد استفاده
• محیط کشت لون اشتاین جانسون (LJ):  ترکیب، اصول، روش آماده‌سازی، نتایج و موارد استفاده
• محیط کشت لوفلر: ترکیب، اصول، روش آماده‌سازی، نتایج و موارد استفاده

منبع

مترجم: صادق حسینی‌کیا