محیط کشت RCM: ترکیبات، آماده سازی، تفسیر و کاربردها

مقدمه‌ای بر محیط کشت RCM

محیط گوشت پخته شده رابرتسون (RCM) برای کشت میکروارگانیسمهای هوازی، بی هوازی و میکروآروفیل به ویژه گونه‌های کلستریدیوم استفاده می‌شود. همچنین به عنوان براث گوشت پخته (CMB) شناخته می‌شود زیرا حاوی تکه‌هایی از گوشت چرخ شده و بدون چربی از قلب گاو و نوترینت براث است. این محیط کشت رشد بی‌هوازی‌های اجباری اسپورساز و غیراسپورساز را ساپورت می‌کند و همچنین بین گونه‌های putrefactive و ساکارولیتیک تمایز قائل می‌شود.

اکسیژن در محیط‌های کشت را میتوان با عوامل مختلفی مانند گلوکز، تیوگلیکولات، قطعات گوشت پخته شده، سیستئین و اسید اسکوربیک کاهش داد.

براث تیوگلیکولات حاوی براث مواد مغذی است و تیوگلیکولات 1 درصد نیز برای کشت میکروارگانیسم بی‌هوازی استفاده می‌شود.

قبل از تلقیح، محیط RCM/CMB را می جوشانند تا بدون اکسیژن شود. پس از تلقیح، روی آن را با یک لایه روغن پارافین مایع استریل می‌پوشانند تا از ورود اکسیژن به محیط جلوگیری شود. مواد تشکیل دهنده محیط به حفظ محیط بی‌هوازی کمک می‌کند.

1. اسیدهای چرب غیراشباع موجود در گوشت از اکسیژن برای اکسیداسیون خودکار استفاده می‌کنند. این واکنش توسط هماتین موجود در گوشت کاتالیز می‌شود.
2. گلوتاتیون و سیستئین موجود در گوشت نیز از اکسیژن استفاده می‌کنند.
3. ترکیبات سولفیدریل (موجود در سیستئین) نیز به پتانسیل واکنش اکسیداسیون-کاهشی کمک می‌کنند.

ترکیبات محیط کشت RCM

مواد لازم به ازای هر لیتر آب دیونیزه:

• محیط کشت گوشت پخته 250.0 گرم
• پپتیک دایجست بافت حیوانی 17.5 گرم
• دکستروز 5.0 گرم
• کلرید سدیم 5.0 گرم
• عصاره مخمر 5.0 گرم
• براده آهن 10.0 گرم
• هیمین 10.0 میلی لیتر
• ویتامین K 10.0 میلی لیتر
• pH نهایی 6.8 +/- 0.3  در 25 درجه سانتیگراد.

محیط کشت RCM (گوشت پخته): ذرات گوشت به عنوان یک ماده کاهش دهنده و سم‌زدا عمل می‌کند و در نتیجه محصولات جانبی مضری را که ممکن است توسط ارگانیسم در حال تکثیر، تولید شوند از کار می‌اندازند. از آنجایی که مواد کاهنده در پروتئین دناتوره شده بیشتر وجود دارد، ذرات گوشت قبل از استفاده در محیط پخته می‌شوند.

براده‌های آهن: ماده کاهنده. براده‌های آهن و بافت ماهیچه‌ای اجازه رشد بی‌هوازی‌های سخت را می‌دهد.

مکمل‌های غذایی: نیازهای غذایی مورد نیاز اکثر باکتری‌ها از طریق گوارش پپتیک بافت‌های حیوانی، عصاره مخمر و دکستروز تامین می‌شود. هیمین و ویتامین K برای تقویت رشد میکروارگانیسم‌های بی هوازی اضافه می‌شوند. اسیدهای آمینه و سایر مواد مغذی نیز توسط پروتئین ماهیچه‌ای در بافت قلب تامین می‌شود.

آماده سازی محیط کشت RCM

1. محیط کشت RCM از گرانول‌های آماده تهیه می‌شود که از اکثر شرکتهای تجاری تهیه کننده محیط‌های کشت می‌توان سفارش داد.
2. محیط کشت را به میزان 1 گرم در بطری یا تیوب‎های درپوش دار بریزید.
3. 10 میلی لیتر آب مقطر اضافه کنید، مخلوط کنید و اجازه دهید به مدت 5 دقیقه با هم مخلوط شوند.
4. محیط را با اتوکلاو (با درپوش‌های باز شده) در دمای 121 درجه سانتی گراد به مدت 15 دقیقه استریل کنید. وقتی خنک شد، درب بطری‌ها را محکم کنید. تاریخ تهیه محیط کشت را تعیین کنید و شماره مخصوص به آن بدهید.
5. محیط را در یک مکان تاریک و خنک نگهداری کنید، مطمئن شوید که درپوش‌های بطری محکم بسته شده‌اند.

ماندگاری: 2 سال، مشروط بر اینکه تغییری در حجم یا ظاهر محیط بوجود نیامده باشد چرا که نشان دهنده آلودگی است.

pH محیط باید در محدوده 7.0-7.4 در دمای اتاق باشد.

تلقیح

بسته به نمونه، محیط کشت RCM شده با استفاده از سواب، پیپت پاستور یا حلقه سیمی تلقیح می‌شود. در صورت استفاده از سواب، سواب باید در ته ظرف قرار داده شود.

برای کشت بی‌هوازی‌های سخت، بهتر است از این محیط به‌صورت تازه یا پس از قرار دادن (درپوش بطری باز شود) در ظرف حاوی آب جوش به مدت 10 تا 15 دقیقه استفاده شود و یا در بن ماری یا حمام آب با دمای 80 درجه سانتی‌گرادو به مدت 30 دقیقه قرار دهید تا اکسیژن خود را از دست بدهد. قبل از تلقیح، اجازه دهید تا در دمای اتاق خنک شود. سطح محیط CMB ممکن است با یک لایه پارافین مایع استریل پوشانده شود.

تفسیر

واکنش ساکارولیتیک با رنگ قرمز گوشت و بوی ترش به دلیل تجزیه کربوهیدرات نشان داده می‌شود. واکنش پروتئولیتیک با سیاه شدن گوشت و بوی بسیار نامطبوع به دلیل تجزیه پروتئین نشان داده می‌شود.

1. Clostridium perfringens: بی‌هوازی ساکارولیتیک (رنگ تکه‌های گوشت را به قرمز تبدیل می‌کند)
2. کلستریدیوم تتانی: بی‌هوازی پروتئولیتیک (سیاه شدن گوشت)

موارد استفاده از محیط کشت RCM

1. پرورش میکروارگانیسم‌های هوازی، بی هوازی و میکروآئروفیل به ویژه گونه‌های کلستریدیوم. رشد بی‌هوازی‌های اجباری اسپورساز و غیراسپور ساز را ساپورت می‌کند.
2. به عنوان محیط غنی برای پرورش موجودات با تلقیح بسیار اندک مفید است.
3. علاوه بر این، محققان دریافته‌اند که محیط گوشت پخته شده زنده ماندن موجودات را در مدت زمان طولانی حفظ می‌کند و در حفظ موجودات بی هوازی مفید است.
4. سازمان غذا و دارو استفاده از آن را برای شمارش و شناسایی کلستریدیوم پرفرنجنس در غذا توصیه می‌کند.

همچنین بخوانید:

• مارتین لوئیس آگار (Martin Lewis Agar): ترکیب، اصول، روش آماده‌سازی، نتایج و موارد استفاده
• محیط انتقال آمیس ترانسپورت (Amies Transport Medium): ترکیب، اصول، آماده‌سازی، نتایج و موارد استفاده
• محیط کشت CIN یا یرسینیا: اصول، ترکیب، روش آماده‌سازی و موارد استفاده
• محیط کشت VRBA (ویولت رد بایل آگار): ترکیب، اصول، آماده‌سازی، نتایج و موارد استفاده

مترجم: معصومه قریبی ششده

منبع