محیط کشت VRBA: ترکیب، اصول، آماده‌سازی، نتایج و کاربرد

فهرست مطالب نمایش

مقدمه‌ای بر محیط کشت VRBA

کلیفرم‌ها (Coliform) به تمام باکتری‌های میله‌ای شکل هوازی و اختیاری بی‌هوازی، گرم منفی و غیر اسپوردار (Spore) اطلاق می‌شود که لاکتوز را با تشکیل گاز و اسید ظرف 48 ساعت در دمای 35 درجه سانتی‌گراد تخمیر می‌کنند. روش‌هایی برای شناسایی، شمارش و شناسایی احتمالی کلیفرم‌ها در آزمایش غذاها و محصولات لبنی استفاده می‌شود.

یکی از روش‌های انجام آزمایش شناسایی احتمالی کلیفرم‌ها از ویولت رد بایل آگار (Violet Red Bile Agar (VRBA)) استفاده می‌کند. محیط کشت VRBA یک محیط انتخابی است که برای شناسایی و شمارش میکروارگانیسم‌های کلیفرم تخمیرکننده لاکتوز استفاده می‌شود.

ترکیبات محیط کشت VRBA

مواد تشکیل دهنده	گرم در لیتر
پپتیک دایجست (Peptic digest) بافت حیوانی	7
عصاره مخمر	3
کلرید سدیم	5
مخلوط نمک‌های صفراوی	1.5
لاکتوز	10
نوترال رد (Neutral red)	0.03
کریستال ویولت (Crystal violet)	0.002
آگار	15

pH نهایی (در دمای 25 درجه سانتی‌گراد): 0.2± 7.4

اصول محیط کشت VRBA

محیط کشت VRBA بر استفاده از اجزای مهارکننده انتخابی کریستال ویولت و نمک‌های صفراوی و سیستم نشانگر لاکتوز و نوترال رد متکی است.
کریستال ویولت و نمک‎های صفراوی عمدتا رشد باکتری‌های گرم مثبت همراه با فلور (Flora) باکتریایی را مهار می‌کنند.
تجزیه لاکتوز به اسید با نشانگر PH نوترال رد که رنگ آن را به قرمز تغییر می‌دهد و با رسوب اسیدهای صفراوی نشان داده می‌شود.
بنابراین رشد بسیاری از ارگانیسم‌های ناخواسته سرکوب می‌شود، در حالی که می‌توان به طور احتمالی باکتری‌های مورد نظر را شناسایی کرد.
ارگانیسم‌هایی که به سرعت به لاکتوز حمله می‌کنند، کلنی‌های بنفش رنگی تولید می‌کنند که توسط هاله‌های ارغوانی احاطه شده‌اند. غیر تخمیرکننده‌ها یا تخمیرکننده‌های لاکتوز دیررس کلنی‌های کم رنگ با نواحی سبز رنگ ایجاد می‌کنند.

کلنی‌های قرمز، احاطه شده توسط نواحی رسوبی مایل به قرمز با قطر 1 تا 2 میلی‌متر: انتروباکتریاسه (Enterococci) لاکتوز مثبت: باکتری کلیفرم، اشریشیا کلی (E. coli).

کلنی‌های کوچک صورتی: انتروکوک (Enterococci)، احتمالا کلبسیلا (Klebsiella).

کلنی‌های بی‌رنگ: انتروباکتریاسه لاکتوز منفی

پپتیک دایجست بافت حیوانی و عصاره مخمر به عنوان منابع کربن، نیتروژن، ویتامین‌ها و سایر مواد مغذی ضروری برای رشد عمل می‌کنند.
لاکتوز یک کربوهیدرات قابل تخمیر است که استفاده از آن منجر به تولید اسید می‌شود.
نشانگر نوترال رد، اسیدیته تشکیل شده را تشخیص می‌دهد.
مخلوط کریستال ویولت و نمک‌های صفراوی به مهار فلور گرم مثبت و نامرتبط همراه کمک می‌کند. کلرید سدیم تعادل اسمزی (Osmotic equilibrium) را حفظ می‌کند.

آماده‌سازی و روش استفاده از محیط کشت VRBA

53 گرم را در 1000 میلی‌لیتر آب مقطر بریزید.
در حین هم زدن، حرارت دهید تا به جوش بیاید و محیط کاملا حل شود.

توجه: اتوکلاو نکنید.

آن را تا دمای 45 درجه سانتی‌گراد خنک کرده و در پلیت‌های پتری (Petri plate) استریل حاوی ماده تلقیح بریزید.
مقدار 1 میلی‌لیتر از نمونه آزمایش را به پتری دیش منتقل کنید.
10 میلی لیتر ویولت رد بایل آگار (در دمای 48 درجه سانتی‌گراد) به آن اضافه کنید و هم بزنید تا مخلوط شود.
قبل از انکوباسیون، در دمای 35 درجه سانتی‌گراد به مدت 18 تا 24 ساعت اجازه دهید تا محیط جامد شود. برای محصولات لبنی از دمای 32 درجه سانتی‌گراد استفاده کنید.
وجود کلنی‌های بنفش قرمز با قطر 0.5 میلی‌متر (یا بزرگتر) که توسط ناحیه‌ای از رسوبات اسیدهای صفراوی احاطه شده‌اند را بررسی کنید.
کار را با آزمایش تاییدی کلنی‌های ارگانیسم‌های معمولی ادامه دهید.

تفسیر نتایج در ویولت رد بایل آگار (VRBA)

ارگانیسم	رشد
انتروباکتر آئروژنز (Enterobacter aerogenes)	کلنی‌های مخاطی، صورتی تا صورتی مایل به قرمز
اشرشیا کلی	کلنی‌های قرمز مایل به صورتی با رسوب صفرا
سالمونلا انتریتیدیس (Salmonella Enteritidis)	کلنی‌های بی‌رنگ تا زرد مایل به نارنجی
سالمونلا تیفی موریوم (Salmonella typhimurium)	رشد متوسط تا خوب؛ کلنی‌های بی رنگ
استافیلوکوکوس اورئوس (Staphylococcus aureus)	مهار جزئی تا کامل

موارد استفاده از محیط کشت VRBA

VRBA برای جداسازی، شناسایی و شمارش باکتری‌های coli-aerogenes در آب، شیر و سایر محصولات غذایی لبنی و همچنین از نمونه‌های بالینی استفاده می‌شود.

محدودیت‌های محیط کشت VRBA

محیط کشت VRBA کاملاً مخصوص باکتری‌های روده‌ای نیست. سایر باکتری‌های همراه ممکن است همین واکنش را نشان دهند.
با توجه به نیازهای غذایی متفاوت، ممکن است برخی از سویه‌ها مشاهده شوند که رشد ضعیفی دارند یا در این محیط رشد نمی‌کنند.
VRBA ممکن است به طور کامل برای ارگانیسم‌های گرم مثبت مهارکننده نباشد و باسیل‌های گرم منفی غیر از اعضای انتروباکتریاسه رشد کنند. برای شناسایی ایزوله‌ها، رنگ‌آمیزی گرم (Gram stain) و آزمایشات بیوشیمیایی انجام دهید.
جوشاندن محیط برای بیش از 2 دقیقه می‌تواند توانایی حمایت از رشد را کاهش دهد.
توصیه می‌شود برای شناسایی کامل، آزمایشات بیوشیمیایی، ایمونولوژیک، مولکولی یا طیف‌سنجی جرمی روی کلنی‌های حاصل از کشت خالص انجام شود.
انتروکوک‌ها ممکن است در این محیط رشد کنند و در این صورت، معمولاً از نظر اندازه کوچک و به رنگ سرخ ظاهر می‌شوند.
ویولت رد بایل آگار برای استفاده در تشخیص بیماری یا سایر شرایط در انسان ساخته نشده است.

همچنین بخوانید:

منبع

مترجم: صادق حسینی کیا

از این مطلب چقدر راضی بودید؟

روی ستاره کلیک کنید تا نظرتون ثبت بشه