میکروسکوپ کانفوکال: تعریف، اساس، قطعات، انواع و کاربردها

میکروسکوپ کانفوکال چیست؟

مفهوم میکروسکوپ کانفوکال در ابتدا توسط ماروین مینسکی در دهه 1950 در دانشگاه هاروارد با هدف مشاهده شبکه عصبی بدون رنگ آمیزی بافت ها ایجاد شد، اما به دلیل کمبود منبع نور کافی و یک سیستم کامپیوتری برای ذخیره سازی داده‌ها، ثمربخش نبود.

این اثر بعداً توسط دیوید ایگر ام و مجمیر پتران اقتباس شد و در اواخر دهه 1960 یک میکروسکوپ کانفوکال چند پرتوی را تشکیل داد. آنها از یک دیسک چرخان به نام Nipkow استفاده کردند که از آن برای بررسی بافت های مغز و سلول‌های گانگلیونی که رنگ نشده بودند استفاده کردند. این تکنیک بعدها توسط Egger اصلاح و منتشر شد و میکروسکوپ لیزری کانفوکال اسکن مکانیکی را تشکیل داد که قادر به تجسم تصاویر سلول‌ها بود.

پیشرفت‌های بعدی در علم از جمله توسعه رایانه‌ها و فناوری لیزر و دست‌کاری‌های دیجیتالی تصاویر با استفاده از الگوریتم‌ها، پیشرفت‌ها در میکروسکوپ کانفوکال را افزایش داد و میکروسکوپ‌های کانفوکال عملاً قابل استفاده توسط تعدادی از دانشمندان از جمله فرد برکنهوف (1979)، کالین شپارد، تونی ویلسون، برد آموس و جان وایت  را تشکیل داد (دهه 1980).

اولین میکروسکوپ کانفوکال تجاری در سال 1987 با اپتیک و الکترونیک بهبود یافته و لیزرهای قدرتمند با راندمان اسکن بالا ساخته شد.

میکروسکوپ کانفوکال مدرن تمام ادغام فناوری و اجزای مکانیکی از جمله اجزای نوری را دارد که عملکرد اصلی پیکربندی را با استفاده از آشکارسازهای الکترونیکی، رایانه و سیستم‌های لیزری انجام می‌دهند.

عملکرد میکروسکوپ کانفوکال یک نقش جمعی از تمام اجزای آن برای تولید یک تصویر الکترونیکی است. تا به امروز از این میکروسکوپ‌ها برای بررسی مولکول‌ها، سلول‌های میکروبی و بافت ها استفاده شده است.

اساس میکروسکوپ کانفوکال

معمولاً یک میکروسکوپ معمولی (میدان وسیع) از طول موج‌های متفاوتی از یک منبع نور برای تجسم و روشن کردن یک منطقه بزرگ از نمونه استفاده می‌کند و تصاویر مبهم، تیره و شلوغ را تشکیل می‌دهد، زیرا تصاویر نمونه سلولی از همه جهات و بدون نقطه کانونی گرفته می‌شوند.

برای جلوگیری از این مشکلات، از میکروسکوپ کانفوکال استفاده می‌شود. در میکروسکوپ‌های میدان وسیع یا فلورسنت، کل نمونه نور دریافت می‌کند و نوری را ساطع می‌کند که توسط یک آشکارساز نوری روی میکروسکوپ شناسایی می‌شود. با این حال، با میکروسکوپ کانفوکال، روشنایی نقطه‌ای مکانیزم اصلی کار است.

نمونه‌ای که با فلوروکروم رنگ آمیزی شده است مورد بررسی قرار می‌گیرد. هنگامی که یک پرتو نور در نقطه خاصی از نمونه فلوئورو – کروماتیک متمرکز می‌شود، نوری تولید می‌کند که توسط عدسی شیئی به صفحه‌ای بالاتر از هدف متمرکز می‌شود. شیئی دارای یک دیافراگم در صفحه کانونی واقع در بالای آن است که در درجه اول عملکرد، نور سرگردان را از رسیدن به نمونه مسدود می‌کند.

نقطه روشنایی حدود 0.25 تا 0.8 میکرومتر قطر دارد که توسط دیافراگم عددی عینی و عمق 0.5 تا 1.5 میکرومتر و با روشن‌ترین شدت تعیین می‌شود.

نمونه معمولاً بین لنز دوربین و نقطه فوکوس کامل که به عنوان صفحه فوکوس شناخته می‌شود قرار دارد. با استفاده از لیزر میکروسکوپ، لیزر بر روی یک صفحه روی نمونه یا با حرکت دادن صفحه اسکن می‌کند. سپس یک آشکارساز نور را اندازه گیری می‌کند و تصویری از بخش نوری ایجاد می‌کند. با اسکن چندین بخش نوری، آنها در یک سیستم کامپیوتری به عنوان داده جمع آوری می‌شوند و یک تصویر سه بعدی را تشکیل می‌دهند. تصویر را می‌توان اندازه گیری و کمی کرد.

نتیجه آن نیز توسط دیافراگم یافت شده در بالای شیئی که نور سرگردان را مسدود می‌کند، مشخص است.

تصاویر تولید شده توسط میکروسکوپ کانفوکال علی‌رغم ضخامت نمونه، ظرفیت انقباض و تفکیک بسیار خوبی دارند. تصاویر در تصویر سه بعدی با وضوح بالا از کمپلکس‌های سلولی از جمله ساختار آنها ذخیره می‌شوند.

ویژگی اصلی میکروسکوپ کانفوکال این است که فقط آنچه را که فوکوس شده است تشخیص می‌دهد و هر چیزی خارج از نقطه فوکوس سیاه به نظر می‌رسد.

تصویر نمونه زمانی تشکیل می‌شود که اسکنر میکروسکوپ، پرتو متمرکز را در یک منطقه انتخاب شده با کنترل دو آینه نوسانی با سرعت بالا اسکن می‌کند. حرکت آنها توسط موتورهای گالوانومتر تسهیل می‌شود. یک آینه پرتو را از چپ به راست در محور X جانبی حرکت می‌دهد در حالی که آینه دوم پرتو را در امتداد محور Y منتقل می‌کند. پس از اسکن در محور X، پرتو به سرعت به نقطه شروع حرکت می‌کند تا یک اسکن جدید آغاز شود، و این فرایندی است که به عنوان فلای بک شناخته می‌شود. هیچ اطلاعاتی در طول فرایند فلای بک جمع آوری نمی‌شود، بنابراین نقطه تمرکز، که ناحیه مورد نظر است، همان چیزی است که توسط اسکنر لیزری روشن می‌شود.

بخش‌هایی از میکروسکوپ کانفوکال

میکروسکوپ اسکن لیزری کانفوکال از چند جزء تشکیل شده است:

• عدسی شیئی
• سطح خارج از فوکوس
• سطح فوکوس
• شکافنده پرتو
• آشکارساز
• حفره کوچک کانفوکال (دیافراگم)
• لیزر
• آینه‌های نوسانگر

انواع میکروسکوپ کانفوکال

1. میکروسکوپ اسکن لیزری کانفوکال – از چندین آینه استفاده می‌کند که در امتداد محورهای X و Y روی نمونه، اسکن می‌شوند و تصویر از طریق حفره کوچک به سمت آشکارساز عبور می‌کند.
2. دیسک اسپینینگ که به دیسک Nipkow نیز معروف است، نوعی میکروسکوپ کانفوکال است که از چندین حفره کوچک متحرک (پین هول) روی یک دیسک برای اسکن نقاط نور به صورت موازی در یک صفحه مشخص، در مدت زمان طولانی استفاده می‌کند. در مقایسه با میکروسکوپ اسکن لیزری کانفوکال، هر چه زمان طولانی‌تر باشد، انرژی تحریک مورد نیاز برای روشنایی کمتر است. کاهش انرژی تحریک، سمیت نوری (فوتوتوکسیتی) و سفید شدن نور (فوتو بلیچینگ) را کاهش می‌دهد، از این رو عمدتاً برای تصویربرداری از سلول‌های زنده استفاده می‌شود.
3. میکروسکوپ کانفوکال تقویت شده با دیسک دوگانه یا میکرو لنز _ اختراع شده توسط Yokogawa electric. این دیسک شبیه به دیسک چرخان کار می‌کند، تنها تفاوت آن این است که یک دیسک چرخان دوم با لنزهای میکرو دارد که قبل از دیسک چرخشی که حاوی سوراخ‌های سوزنی است قرار دارد. لنزهای میکرو پهنای باند نور را جذب می‌کنند و آن را به همه حفره‌های کوچک متمرکز می‌کند، بنابراین مقدار نوری را که به هر سوراخ سوزنی هدایت می‌شود افزایش می‌دهد و مقدار نوری را که توسط دیسک چرخان مسدود می‌شود کاهش می‌دهد. این میکروسکوپ‌های کانفوکال با میکرو لنزهای پیشرفته بسیار حساس‌تر از دیسک‌های چرخان هستند.
4. میکروسکوپ آرایه‌ای قابل برنامه‌ریزی (PAM) – این نوع میکروسکوپ کانفوکال از یک تعدیل‌کننده نور فضایی استفاده می‌کند (SLM – جسمی که نوعی مدولاسیون فضایی متغیر را بر پرتوی نور تحمیل می‌کند). SLM دارای مجموعه‌ای از دیافراگم‌های متحرک (پین‌هول‌ها)، با آرایه‌هایی از پیکسل‌های تار، بازتاب‌پذیری یا چرخش نور است. SLM همچنین دارای آینه‌های میکرو الکتروشیمیایی است که تصویر را توسط دستگاه تزویج باری (CCD) می‌گیرد.

هر کدام از میکروسکوپ‌های کانفوکال مزایا و معایب خود را دارند، اما همه آنها با ثبت تصاویر، تصاویر را ثبت می‌کنند و گاهی اوقات می‌توان آنها را طوری برنامه ریزی کرد که بتوان به تصاویری با چگالی بالا دست یافت، به خصوص میکروسکوپ آرایه‌ای قابل برنامه ریزی و میکروسکوپ کانفوکال دیسک اسپینینگ.

کاربردهای میکروسکوپ کانفوکال

میکروسکوپ کانفوکال در طیف وسیعی از زمینه‌ها از جمله علوم زیست پزشکی، زیست شناسی سلولی، ژنتیک، میکروبیولوژی، زیست شناسی رشد، طیف سنجی، علوم نانو (نانو تصویربرداری) و اپتیک کوانتومی استفاده می‌شود.

در علوم زیست پزشکی، از آن در تجزیه و تحلیل عفونت‌های قرنیه چشم، و آنالیز کمی و کیفی سلول‌های اندوتلیال قرنیه استفاده می‌شود.

برای شناسایی وجود عناصر قارچی در استرومای قرنیه، در هنگام عفونت کراتومیکوزیس، یا تشخیص سریع و پاسخ درمانی سریع استفاده می‌شود.

همچنین در صنایع داروسازی و کنترل کیفیت و یکنواختی توزیع دارو استفاده می‌شود.

برای بازیابی داده‌ها از برخی از سیستم‌های ذخیره سازی نوری سه بعدی استفاده می‌شود. این به تعیین کمیت سن پاپیروس مگدالن کمک کرده است.

مزایا

• مزیت میکروسکوپ کانفوکال این است که نتیجه تصویر را بهبود می‌بخشد؛ زیرا تصویر را از یک نقطه نوری به نقطه دیگر تجزیه و تحلیل می‌کند، بنابراین هیچ تداخلی با نور پراکنده از سایر قسمت‌های نمونه وجود ندارد.
• وضوح بهتری دارند و از هر نقطه مورد نظر تجسم و ضبط می‌شود.
• می‌توان از آن برای مطالعه سلول‌های زنده و ثابت استفاده کرد
• می‌توان از آن برای جمع آوری بخش‌های نوری زنجیره‌ای استفاده کرد.
• در سراسر نقاط فوکوس به طور یکنواخت روشن می‌شود.
• این دستگاه‌ها بزرگ‌نمایی خود را به صورت الکترونیکی، بدون تغییر اهداف، با فاکتوری به نام ضریب بزرگ‌نمایی تنظیم می‌کنند.
• مجموعه‌ای از تصاویر سه بعدی تولید می‌کند.

محدودیت‌ها

• آنها دارای تعداد محدودی از طول موج‌های تحریک، با باندهای بسیار باریک هستند.
• آنها برای تولید پرتوهای فرابنفش مورد استفاده توسط میکروسکوپ‌های کانفوکال گران قیمت هستند
• همچنین ساخت و خرید آنها گران قیمت است.

 همچنین بخوانید:

• میکروسکوپ دیجیتالی (Digital Microscope): تعریف، اصول، قطعات، انواع، نمونه‌ها و موارد استفاده
• میکروسکوپ زمینه تاریک (Darkfield Microscope): تعریف، اصول، کاربردها و نمای آن
• میکروسکوپ استریو (Stereo Microscope): کاربرد، اجزا، روش کار، مزایا و معایب
• فولدسکوپ چیست؟ آشنایی با میکروسکوپ کاغذی و ویژگی های آن
• میکروسکوپ نیروی اتمی (AFM): اصول کار، قطعات و کاربرد

منبع

مترجم: مریم محجوب