بافر TBE چیست؟ نحوه آماده‌سازی بافر TBE

فهرست مطالب نمایش

چگونه بافر TBE (Tris Borate EDTA) را تهیه کنیم؟

TBE که به عنوان Tris Borate EDTA نیز شناخته می‌شود، محلول بافری است که از تریس باز، اسید بوریک و EDTA تشکیل شده است. معمولاً در الکتروفورز اسید نوکلئیک استفاده می‌شود. این محلول تحت شرایطی به طور موثر عمل می‌کند و DNA را پروتون زدایی کرده و از تخریب آن محافظت می‌کند. این غلظت را می‌توان به راحتی قبل از استفاده به 1x یا 0.5x رقیق کرد (با آب گرید بیولوژی مولکولی).

بافرهای TBE و TAE (Tris Acetate EDTA) اغلب در تکنیک‌های زیست شناسی مولکولی شامل اسیدهای نوکلئیک به کار می‌روند که محبوب‌ترین آن‌ها الکتروفورز است. محلول‌های تریس اسید بافرهای خوبی هستند زیرا DNA را ازحالت پروتونه خارج کرده و در آب محلول نگه می دارند. EDTA یک شلاتور کاتیونی دو ظرفیتی، به ویژه منیزیم (Mg2+) بوده است. از آنجایی که این یون‌ها برای بسیاری از آنزیم‌ها، از جمله نوکلئازهای آلاینده، کوفاکتور مورد نیاز هستند، وظیفه EDTA محافظت از اسیدهای نوکلئیک در برابر تجزیه آنزیمی است.

تریس دارای محدوده موثر 7-9 است. اسید بوریک دارای محدوده pH موثر 8-10 است. بر اساس این داده‌ها، همپوشانی خواص بافری هر دو 8-9 است. در نتیجه، pH 8.3 ایده آل تعیین شد. برای انجام این روند از NaOH/HCl استفاده می‌شود.

آماده سازی بافر بدون تنظیم قابل تکرار است. به خاطر داشته باشید که PH مترهای کالیبره نشده دارای میزانی بی‌دقتی هستند، بنابراین اگر PH ترکیبات محلول نزدیک به مقدار پیش بینی شده باشد، گاهی اوقات توصیه می‌شود از بافرهای تنظیم نشده استفاده کنید.

معرف‌های مورد نیاز برای تهیه بافر TBE:

اسید بوریک
تریس
Na2EDTA
آب مقطر
HCl / NaOH
ابزار مورد نیاز برای تهیه بافر TBE (Tris Borate EDTA)
تعادل توزین
بشر شیشه‌ای
همزن مغناطیسی و پلت
پیپت
PH متر
سیلندرهای اندازه‌گیری
اتوکلاو یا فیلتر

روش آماده‌سازی بافر TBE

¾ حجم مورد نظر آب مقطر را در ظرف یا فلاسک پر کنید.
با استفاده از ترازو، مقادیر مناسبی از مواد شیمیایی را آماده کنید. اگر محلول EDTA دارید، حجم آن را اندازه بگیرید و آن را به سرعت با آب مخلوط کنید.
معرف‌ها باید در آب حل شوند. با حل شدن پایه تریس، pH باید افزایش یابد. هرچه PH بیشتر باشد، حل شدن EDTA آسان‌تر می‌شود، اگرچه هنوز یک فرآیند کند است. به خصوص در این مرحله، همزن مغناطیسی بسیار مفید است.
در صورت لزوم، pH را با استفاده از HCl تنظیم کنید.
آب مقطر را به حجم به دست آمده اضافه کنید تا به حجم مورد نیاز برسد.
محلول باید اتوکلاو یا فیلتر شود (به خصوص اگر می‌خواهید همراه آن RNA استفاده کنید).

تهیه بافر 10x TBE

معرف‌های مورد نیاز

108 گرم تریس
55 گرم اسید بوریک
40 میلی لیتر Na2EDTA 0.5 مولار (pH 8.0) / می‌توانید از 9.3 گرم Na2EDTA استفاده کنید.
900 میلی لیتر آب مقطر

روش آماده‌سازی بافر 10x TBE

900 میلی‌لیتر آب مقطر را در یک بالن/پیمانه نگه دارید، 108 گرم تریس و 55 گرم اسید بوریک اضافه کنید و با همزن مغناطیسی خوب هم بزنید.
40 میلی لیتر Na2EDTA
0.5 مولار (pH 8.0) (یا 9.3 گرم Na2EDTA) به محلول اضافه کنید.
حجم را با استفاده از آب مقطر روی 1 لیتر تنظیم کنید.
می‌توان آن را در دمای اتاق نگهداری کرد.

تهیه بافر 1x TBE

معرف‌های مورد نیاز

10.8 گرم تریس
5.5 گرم اسید بوریک
4 میلی لیتر Na2EDTA 0.5 مولار (pH 8.0)
900 میلی لیتر آب مقطر

روش تهیه بافر 1x TBE

900 میلی‌لیتر آب مقطر را در یک بالن/پیمانه نگه دارید، 10.8 گرم تریس و 5.5 گرم اسید بوریک اضافه کنید و با همزن مغناطیسی خوب هم بزنید.
4 میلی لیتر Na2EDTA 0.5 مولار (pH 8.0) به محلول اضافه کنید.
حجم را با استفاده از آب مقطر روی 1 لیتر تنظیم کنید.
می‌توان آن را در دمای اتاق نگهداری کرد.

کاربرد بافر TBE

بافر TBE رایج‌ترین بافر مورد استفاده برای الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید DNA و RNA است.
بافر TBE برای الکتروفورز ژل میدان پالسی (PFGE) استفاده شده است.
اگرچه TBE را می‌توان برای ژل‌های آگارز استفاده کرد، اما در ژل‌های مورد استفاده برای بازیابی اسید نوکلئیک توصیه نمی‌شود.
TBE با ژل‌های غیر دناتوره کننده یا دناتوره کننده (اوره 7 مولار) استفاده می شود. همچنین معمولاً برای ژل تعیین توالی خودکار DNA استفاده می‌شود.

ذخیره سازی

بافر TBE را می‌توان تا سه ماه در دمای اتاق نگهداری کرد.

موارد احتیاط

اسید بوریک سمی است. در نتیجه از دستکش استفاده کنید و از تماس با آن خودداری کنید.
پایه تریس برای پوست و چشم‌ها تحریک کننده است.
EDTA باعث تحریک چشم می‌شود.

همچنین بخوانید: