نحوه استخراج ژنوم باکتری

استخراج ژنوم باکتری

باکتری شناسی به بخش جدایی ناپذیر از علم زیست شناسی مولکولی تبدیل شده است. تکنیک های مولکولی مختلفی برای شناسایی و طبقه بندی گونه های مختلف باکتریایی استفاده می شود.

از جمله این تکنیک ها می توان به واکنش زنجیره ای پلیمراز یا PCR، پلی مورفیسم قطعات طولی محدود شونده یا PCR RFLP، تکنیک های هیبریداسیون و تعیین توالی DNA اشاره نمود. در حقیقت بسیاری از سویه های باکتریایی اکنون ویژگیهای طبقه بندی شده بر پایه تکنیک های مولکولی دارند.

از آنجایی که تکنیک های مولکولی در باکتری شناسی معمولا با استخراج و خالص ساز DNA باکتریایی همراه هستند، لذا یادگیری استخراج ژنوم باکتریایی به روش ساده و کم هزینه الزامی می باشد.

برای جداسازی DNA ژنومی از سلول های باکتریایی تکنیک های بسیاری وجود دارد که همگی مراحل تقریبا مشابهی دارند. از جمله ی این مراحل می توان به شکستن سلول و حذف پروتئین ها، کربوهیدرات ها و قندها اشاره کرد.

روش های متعدد استخراج DNA باکتریایی به صورت دستی و یا اتوماسیون انجام می شود. روش های متعدد استخراج DNA هنوز هم در حال توسعه می باشد که هر کدام از روش های استخراج DNA باکتریایی یکسری مزایا و معایب خاص خود را دارند. بسیاری از این روش ها مبتنی بر روش سنتی استخراج فنل کلروفورم است که به تجهیزات و مواد مختلفی نیاز دارد.

علاوه بر این، چندین روش برای سهولت روش استخراج و خالص سازی DNA باکتریایی انجام شده است. این روش ها سلول ها را لیزر می کنند و منجر به آزادسازی DNA با استفاده از عوامل لیز کننده ی خاص می شوند که شامل مواد شیمیایی مختلفی مانند لیزوزوم، پروتئیناز k، tween20، سدیم دو دسیل سولفات یا SDS، گوانیدین ایزوتیوسیونات و تریتون x-100 می باشد.

علاوه بر عوامل شیمیایی، فاکتورهای فیزیکی مانند حرارت، سرمادهی، انجماد، تشعشعات مایکوویو، beads beting، میدان مغناطیسی، استفاده از امواج فراصوت و… نیز مورد استفاده قرار می گیرد. بسیاری از تکنیک های استخراج DNA ترکیبی از روش های فیزیکی و شیمیایی می باشد. با این همه بسیاری از این تکنیک های استخراج DNA همچنان آزمایشگاهی، گران و زمان بر هستند.

در طول دو دهه ی گذشته، بسیاری از کیت های تجاری برای استخراج DNA باکتریایی توسعه یافته اند که مراحل ساده تری دارد و در یک بازه ی زمانی کوتاه تر عمل استخراج DNA از باکتری را انجام میدهد. اگرچه، این کیت های تجاری فرآیند استخراج DNA از باکتری را سریعتر نموده اند، با این حال این روش ها پرهزینه هستند و برای استخراج DNA هدف، به چندین مرحله و مواد و برخی تجهیزات خاص نیاز دارد.

در روش استخراج DNA به روش جوشاندن، از گرما برای استخراج DNA استفاده می شود که یک روش سریع و ساده و کم هزینه می باشد. استفاده از گرما برای استخراج DNA باکتریایی مبحث جدیدی نمی باشد. قرار گرفتن در معرض دمای بالا باعث آسیب به غشای سلولی و دیواره سلولی می شود.

جو و برهمداتان گزارش دادند که گرم کردن در دمای 94 درجه سانتیگراد به مدت دو دقیقه برای تغییر شکل دیواره های سلولی می شود. درجه حرارت پایین نیز برای از بین بردن دیواره های سلولی و غشاها می شود. انجماد باعث کریستاله شدن آب درون سلول ها می شود که منجر به تخریب ساختارهای سیتوپلاسمی می شود.

در حقیقت تل و همکاران چرخه ی انجماد و ذوب را برای استخراج DNA باکتریایی استفاده نمودند. در عمل، گرم کردن باکتری به منظور استخراج DNA بوسیله ی جوشاندن در بن ماری و یا روی دستگاه هات بلاک و یا مایکوویو انجام می شود.

مایکروویو می تواند باعث اثرات مختلف بیولوژیکی شود که این اثرات بدلیل فرآیند گرمایش (اثرات حرارتی) می باشد. اما اثرات آترومی بر مواد سلولی نیز وجود دارد که به نظر می رسد به دلیل شتاب و تقسیم یونها با سایر مولکول ها، مشارکت یون ها و یا تغییر قطبیت مولکول ها در میدان های الکتریکی متناوب می شود.

در روش استخراج DNA باکتریایی به روش جوشاندن، کلنی های باکتریایی در یک تیوب تست قرار می گیرند که حاوی یک میلی لیتر آب مقطر می باشد و به مدت 10 دقیقه در بن ماری قرار داده می شود. در مرحله ی بعدی به مدت 5 دقیقه با دور rpm 1000 سانتریفیوژ می شود. در نهایت 5 میکرولیتر از مایع رویی برای PCR مورد استفاده قرار می گیرد.

از صفحات زیر دیدن فرمایید:

خدمات میکروبیولوژی

دوره کارآموزی میکروبیولوژی