همه چیز درمورد Real time PCR

همه چیز درمورد Real time PCR

واکنش زنجیره ای پلیمراز در زمان واقعی (Real time PCR) ، که همچنین به عنوان واکنش زنجیره ای پلیمراز کمی (qPCR) شناخته می شود ، یک روش آزمایشگاهی زیست شناسی مولکولی مبتنی بر واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) است.  این آزمایش تکثیر یک مولکول DNA را هدف قرار می دهد در طول PCR (یعنی در زمان واقعی) ، نه در پایان آن ، مانند PCR معمولی. از PCR در زمان واقعی (Real time PCR) می توان به عنوان یک تست کمی و نیمه کمی استفاده کرد.

دو روش معمول برای تشخیص محصولات  در Real time PCR:

1. رنگهای فلورسنت غیر اختصاصی است که به هر DNA دو رشته ای می چسبد
2. پروب هایDNA اختصاصی توالی متشکل از الیگونوکلئوتیدها که با یک گزارشگر فلورسنت برچسب خورده اند ، تلاقی می کنند. ، که تنها پس از ترکیبی از کاوشگر با توالی مکمل آن اجازه تشخیص می دهد.

اصول اساسی

PCR در زمان واقعی (Real time PCR) در یک سیکل حرارتی با ظرفیت نورپردازی هر نمونه با یک پرتو نور حداقل یک طول موج مشخص و تشخیص فلورسانس ساطع شده توسط فلوروفور تحریک شده انجام می شود. سیکل حرارتی همچنین قادر به گرم کردن و سرما زدگی پشت هم نمونه ها است ، از این طریق از خواص فیزیکوشیمیایی اسیدهای نوکلئیک و DNA پلیمراز استفاده می کند.

روند PCR به طور کلی از یک سری تغییرات دما تشکیل شده است که 25-50 بار تکرار می شود. این چرخه ها به طور معمول از سه مرحله تشکیل شده اند: مرحله اول ، در حدود 95 درجه سانتیگراد ، اجازه می دهد تا زنجیره دوتایی اسید نوکلئیک جدا شود. مورد دوم ، در دمای حدود 50-60 درجه سانتیگراد ، اتصال آغازگرها با الگوی DNA را امکان پذیر می کند ؛ سومین ، در دمای 68-72 درجه سانتیگراد ، پلیمریزاسیون انجام شده توسط DNA پلیمراز را تسهیل می کند. به دلیل کوچک بودن قطعات ، مرحله آخر معمولاً در این نوع PCR حذف می شود زیرا آنزیم قادر است تعداد آنها را در طول تغییر بین مرحله تراز و مرحله دناتوراسیون افزایش دهد. بعلاوه ، در PCR چهار مرحله ای ، فلورسانس در طی مراحل کوتاه دمایی که در هر چرخه فقط چند ثانیه طول می کشد ، با دمای مثلا 80 درجه سانتیگراد ، اندازه گیری می شود تا سیگنال ناشی از وجود دایمرهای آغازگر کاهش یابد هنگامی که از یک رنگ غیر خاص استفاده می شود. دما و زمان بندی مورد استفاده برای هر چرخه به پارامترهای متنوعی بستگی دارد ، از جمله: آنزیم مورد استفاده در سنتز DNA ، غلظت یونهای دو ظرفیتی و دئوکسییریبونوکلئوتیدها (dNTPs) در واکنش و دمای پیوند آغازگرها.

طبقه بندی شیمیایی

روش PCR در زمان واقعی را می توان با شیمی مورد استفاده برای تشخیص محصول PCR ، فلوروکروم های خاص یا غیر اختصاصی طبقه بندی کرد.

1. تشخیص غیر اختصاصی: PCR در زمان واقعی با رنگهای اتصال دو طرفه به عنوان گزارشگر

یک رنگ متصل شونده به DNA به تمام دو رشته ای ها (ds) متصل می شود و باعث افزایش عملکرد کوانتومی فلورسانس رنگ می شود. بنابراین افزایش محصول DNA در طی PCR منجر به افزایش شدت فلورسانس اندازه گیری شده در هر چرخه می شود. با این حال ، رنگهای dsDNA مانند SYBR Green به کلیه محصولات dsDNA PCR ، از جمله محصولات غیر اختصاصی PCR (مانند پرایمر-دایمر) می شوند. این می تواند به طور بالقوه با نظارت دقیق مانیت دنباله هدف درگیر شده یا مانع شود.

در PCR زمان واقعی با رنگهای dsDNA واکنش به صورت معمول و با افزودن رنگ dsDNA فلورسنت آماده می شود. سپس واکنش در یک ابزار PCR در زمان واقعی (real time PCR) اجرا می شود و پس از هر چرخه ، شدت فلورسانس با یک ردیاب اندازه گیری می شود. رنگ فقط در صورت اتصال به dsDNA ، فلورسنت می شود. این روش این مزیت را دارد که فقط به یک جفت آغازگر برای انجام تقویت احتیاج دارد که هزینه ها را پایین می آورد. چندین توالی هدف را می توان در لوله با استفاده از انواع مختلف رنگ کنترل کرد.

• تشخیص اختصاصی: روش کاوشگر گزارشگر فلورسنت

پروب های (کاوشگر) گزارشگر فلورسنت فقط DNA حاوی توالی مکمل پروب را تشخیص می دهند. بنابراین ، استفاده از کاوشگر گزارشگر به طور قابل توجهی ویژگی های اخنصاصی را افزایش می دهد ، و انجام این روش را حتی در حضور dsDNA دیگر امکان پذیر می کند. با استفاده از برچسب های مختلف رنگ ، می توان از پروب های فلورسنت در روش های مالتی پلکس برای کنترل چندین توالی هدف در همان لوله استفاده کرد. ویژگی کاوشگرهای گزارشگر فلورسنت همچنین از تداخل اندازه گیری های ناشی از دیمرهای آغازگر جلوگیری می کند ، که از محصولات جانبی بالقوه نامطلوب در PCR هستند. با این حال ، پروب های گزارشگر فلورسنت از اثر مهاری دایمرهای آغازگر جلوگیری نمی کنند ، که ممکن است باعث تجمع محصولات مورد نظر در واکنش شود.

این روش به یک کاوشگر مبتنی بر DNA با یک خبرنگار فلورسنت در یک انتها و یک فرونشست فلورسانس در انتهای مخالف کاوشگر متکی است. نزدیکی خبرنگار با خاموش کننده از تشخیص فلورسانس آن جلوگیری می کند. تجزیه پروب توسط فعالیت اگزونوکلئاز 5 ‘به 3’ پلیمراز Taq ، نزدیکی گزارشگر-فرو برنده را می شکند و بنابراین اجازه می دهد تا انتشار فلورسانس خاموش نشود ، که پس از تحریک با لیزر قابل تشخیص است . بنابراین افزایش محصول مورد هدف پروب گزارشگر در هر چرخه PCR باعث افزایش متناسب فلورسانس به دلیل خرابی پروب و انتشار گزارشگر می شود.

مراحل PCR در زمان واقعی (Real time PCR)

اولین مرحله در واکنش PCR در زمان واقعی تبدیل RNA به DNA مکمل (cDNA) است – این فرآیند به عنوان رونویسی معکوس شناخته می شود. در مرحله بعد از خبرنگاران (Probes) فلورسنت و واکنش PCR  برای تقویت و تشخیص ژن های خاص استفاده می شود. دو نوع گزارشگر فلورسنت معمولاً استفاده می شود. اینها کاوشگرهای SYBR green و Taqman هستند.

SYBR Green رنگی است که فقط هنگامی که به DNA دو رشته ای متصل شود (یعنی محصول PCR) فلورسنت می شود.

کاوشگر Taqman از یک پروب اسید نوکلئیک اسید مخصوص ژن ساخته شده است که به مولکولهای گزارشگر و quencher پیوسته است. این پروب بین آغازگر جلو و معکوس به DNA متصل می شود. در حالی که گزارشگر و quencher به کاوشگر متصل هستند ، quencher  فلورسانس ساطع شده توسط خبرنگار را جذب می کند. در طول مراحل واکنش PCR ، پروب تخریب شده ، خبرنگار را آزاد می کند و اجازه می دهد تا فلورسانس آن شناسایی شود. مزیت روش Taqman این است که پروب هایی با گزارشگرهای رنگی مختلف می توانند در روش های مالتی پلکس ترکیب شوند.

برای هر دو روش SYBR Green و Taqman ، میزان فلورسانس در یک نمونه در “زمان واقعی” تشخیص داده می شود و در برابر تعداد چرخه ترسیم می شود. مقدار فلورسانس متناسب با مقدار محصول PCR است. طراحی آزمایشات PCR در زمان واقعی نیاز به دانش قبلی در مورد توالی ژن و در نظر گرفتن دقیق انواع کنترل ها دارد.

PCR در زمان واقعی (Real time PCR) چگونه کار می کند؟

برای درک اینکه PCR در زمان واقعی چگونه کار می کند ، ما یک تجزیه و تحلیل qPCR را با استفاده از یک طرح تقویت معمول نشان می دهیم. در این نمودار تعداد چرخه های PCR در محور x نشان داده شده است و فلورسانس حاصل از واکنش تقویت که متناسب با مقدار محصول تقویت شده در لوله است ، در محور y نشان داده شده است.

این طرح تقویت دو مرحله را نشان می دهد ، یک مرحله نمایی و به دنبال آن یک فاز فلات غیر نمایی.  در مرحله نمایی ، مقدار محصول PCR در هر چرخه تقریباً دو برابر می شود. با ادامه واکنش ، اجزای واکنش مصرف می شوند و در نهایت به یک یا چند جز components محدود می شوند. در این مرحله ، واکنش کند شده و وارد فاز فلات می شود (چرخه 28–40 در شکل).

در ابتدا ، فلورسانس در سطح پس زمینه باقی می ماند ، و افزایش در فلورسانس قابل ردیابی نیست (چرخه 1-18) حتی اگر محصول بصورت نمایی تجمع یابد. سرانجام ، محصول تقویت شده به اندازه کافی جمع می شود تا سیگنال فلورسانس قابل ردیابی را به دست آورد. شماره ای از چرخه که در آن این عمل رخ می دهد چرخه کمیت یا Cq نامیده می شود. از آنجا که مقدار Cq در فاز نمایی اندازه گیری می شود ، درصورتیکه معرف ها محدود نیستند ، می توان از qPCR در زمان واقعی برای محاسبه قابل اعتماد و دقیق مقدار اولیه الگوی موجود در واکنش بر اساس تابع نمایی شناخته شده توصیف کننده روند واکنش استفاده کرد.

Cq یک واکنش عمدتا با مقدار الگوی موجود در شروع واکنش تقویت تعیین می شود. اگر مقدار زیادی الگو در ابتدای واکنش وجود داشته باشد ، برای جمع شدن محصول کافی برای دادن سیگنال فلورسانس بالاتر از پس زمینه ، به چرخه های تقویت تقریباً کمی نیاز است. بنابراین ، واکنش دیر یا زود هنگام ، Cq خواهد داشت. در مقابل ، اگر مقدار کمی الگوی در آغاز واکنش وجود داشته باشد ، چرخه های تقویت بیشتری برای افزایش سیگنال فلورسانس از پس زمینه مورد نیاز است. بنابراین ، واکنش Cq بالا یا دیررس خواهد بود.  این رابطه اساس جنبه کمی PCR در زمان واقعی را تشکیل می دهد.

کاربرد ها

• کاربردهای تشخیصی

PCR کیفی برای تشخیص سریع اسیدهای نوکلئیک استفاده می شود که تشخیص بیماری های عفونی ، سرطان و ناهنجاری های ژنتیکی است. معرفی سنجش های PCR کیفی به آزمایشگاه میکروبیولوژی بالینی ، تشخیص بیماری های عفونی را به طور قابل توجهی بهبود بخشیده و به عنوان ابزاری برای تشخیص بیماری های تازه ظهور شده ، مانند ویروس های جدید آنفولانزا و کرونا ویروس ، در آزمایش های تشخیصی به کار گرفته شده است.

• مصارف میکروبیولوژیکی

PCR کمی نیز توسط میکروب شناسان مشغول به کار در زمینه های ایمنی مواد غذایی ، فساد مواد غذایی و تخمیر و برای ارزیابی ریزگردها از کیفیت آب (آبهای آشامیدنی و تفریحی) و در حفاظت از سلامت عمومی استفاده می شود.

qPCR همچنین ممکن است برای تقویت نشانگرهای طبقه بندی یا عملکردی ژن ها در DNA گرفته شده از نمونه های محیطی استفاده شود. نشانگرها با قطعات ژنتیکی DNA یا DNA مکمل نشان داده می شوند. با تقویت یک عنصر ظریف خاص ، می توان مقدار عنصر موجود در نمونه را قبل از تقویت کمی کرد. استفاده از نشانگرهای تاکسونومیکی (ژنهای ریبوزومی) و qPCR می تواند به تعیین میزان میکروارگانیسم های موجود در یک نمونه کمک کند و براساس ویژگی مارکر می تواند خانواده ها ، جنس ها یا گونه های مختلفی را شناسایی کند. استفاده از نشانگرهای عملکردی (ژنهای کد کننده پروتئین) می تواند بیان ژن در یک جامعه را نشان دهد ، که ممکن است اطلاعاتی را درباره محیط زیست نشان دهد.

• تشخیص عوامل بیماری زای گیاهی

صنعت کشاورزی به منظور جلوگیری از خسارات اقتصادی و حفاظت از سلامتی ، دائماً در تلاش است تا تکثیرهای گیاهی یا نهال هایی عاری از عوامل بیماری زا تولید کند. سیستم هایی ساخته شده اند که اجازه می دهد مقادیر کمی از DNA Phytophthora ramorum ، اوومایستی که اوکس و گونه های دیگر را از بین می برد ، با DNA گیاه میزبان مخلوط شود.

• شناسایی موجودات اصلاح شده ژنتیکی

qPCR با استفاده از رونویسی معکوس (RT-qPCR) با توجه به حساسیت و دامنه دینامیکی آن در تشخیص DNA ، می تواند برای شناسایی GMO ها (Genetically modified organisms) استفاده شود. گزینه های دیگری مانند DNA یا آنالیز پروتئین معمولاً حساسیت کمتری دارند. در این حالت آغازگرهای خاص استفاده می شود که نه تنها ترنسژن ها ، بلکه پروموتر ، ترمینتور یا حتی توالی های میانی را که در طی فرآیند مهندسی بکار می رود ، تقویت می کند. از آنجا که روند ایجاد یک گیاه تراریخته به طور معمول منجر به قرار دادن بیش از یک نسخه از تراریخته می شود ، مقدار آن نیز معمولاً ارزیابی می شود. این کار اغلب با کمی سازی نسبی با استفاده از یک ژن کنترل از گونه های تحت درمان انجام می شود که فقط به صورت یک نسخه وجود دارد.

• کمی سازی بالینی و ژنوتیپ

ویروس ها می توانند به دلیل عفونت مستقیم یا عفونت های مشترک در انسان وجود داشته باشند که با استفاده از روش های کلاسیک تشخیص را دشوار می کند و می تواند منجر به پیش آگهی و درمان نادرست شود. استفاده از qPCR امکان تعیین کمیت و ژنوتیپ (خصوصیات سویه را که با استفاده از منحنی های ذوب انجام می شود) ویروس ها مانند ویروس هپاتیت B را مجاز می داند. درجه عفونت که به عنوان کپی ژنوم ویروسی در واحد بافت بیمار تعیین می شود ، در بسیاری از موارد مربوط است. به عنوان مثال ، احتمال فعال شدن مجدد ویروس تبخال نوع 1 به تعداد سلولهای عصبی آلوده در گانگلیون مرتبط است. این اندازه گیری یا با رونویسی معکوس یا بدون آن انجام می شود ، زیرا اگر ویروس در هر نقطه از چرخه خود در ژنوم انسان یکپارچه شود ، مانند مواردی که در مورد HPV (ویروس پاپیلومای انسانی) اتفاق می افتد ، جایی که برخی از انواع آن وجود دارد و مرتبط با ظهور سرطان دهانه رحم است.

دوره کارآموزی ژنتیک مولکولی

آزمایشگاه ژنتیک مولکولی ژنیران

خدمات آزمایشگاه ژنتیک مولکولی ژنیران