مقدمه‌ای بر هیستولوژی
هیستو (Histo) یک کلمه یونانی به معنای بافت و شبکه می باشد و در مجموع هیستولوژی (Histology) به معنای مطالعات بافتی می باشد. در تکنیک های مختلف هیستولوژی که با نام هیستوتکنیک نیز شناخته می شوند، برش های عرضی از بافت های مختلف زیر میکروسکوپ بررسی می شوند.
تکنیک های هیستولوژی مجموعاً شامل بخش های مختلفی مانند:
- نمونه برداری (Sampling)
- تثبیت (Fixation)
- پردازش (Processing)
- قالب‌گیری (Embedding)
- برش گیری (Sectioning)
- رنگ آمیزی (Staining)
می باشد.
مطالعه یک بافت به این معناست که از آن یک برش مقطع نازک تهیه شده و همراه با رنگ آمیزی یا بدون آن زیر میکروسکوپ بررسی شود. بافت های مختلف موجودات ویژگی های مختلفی دارد.
برخی از موجودات کلاً تک سلولی یا چند سلولی بوده و بافت مشخصی ندارند. این جانداران را می توان به راحتی با تهیه لام اسمیر مورد مطالعه قرار داد. همچنین در موجودات پر سلولی برخی از بافت های بدون ماتریکس خارج سلول مانند خون با تهیه اسمیر بر روی لام قابل مطالعه هستند. در اسمیر تنها فاکتور مورد نیاز رنگ آمیزی است.
بافت های گیاهی نیز به دلیل وجود دیواره سلولی از استحکام بالایی برخوردار بوده و در اکثر موارد به راحتی با تیغ برش می خورند. یعنی به عبارتی با تیغ می توان یک برش نازک از بافت گیاه تهیه کرده و با اضافه کردن رنگ بر روی لام گذاشته و مورد مطالعه قرار داد.
بافت های جانوری مخصوصاً پستانداران در مطالعات هیستولوژی با هیستوتکنیک مورد مطالعه قرار می گیرند. در مطالعه بافت به روش هیستولوژی، با هدف اینکه ساختار بافت از دست نرود، طی فرآیند های مختلف تثبیت و رنگ آمیزی شده و در برش های مقطع مشخص نازک بررسی می شوند. اولین مرحله تکنیک های هیستولوژی، نمونه برداری است.
در نمونه برداری بافت مورد مطالعه باید کمترین آسیب را متحمل شود. نمونه برداری ممکن است در روش های اتوپسی، بیوپسی، توتال و رادیکال استخراج شود. اتوپسی به معنای برداشت کامل یک بافت از لاشه می باشد. بیوپسی به معنای برداشت یک بخش بسیار کوچکی از بافت برای مطالعات اولیه هیستولوژی می باشد.
توتال به معنای استخراج کامل بخش Abnormal یک بافت است. همچنین رادیکال به معنی استخراج بخشی از بافت سالم به همراه بخش کامل Abnormal می باشد.فرآیند های بیوپسی، توتال و رادیکال بیشتر در بخش های هیستوپاتولوژی و مطالعات بالینی کاربرد دارد. بخش های تحقیقاتی که با حیوانات مدل کار می کنند برای انجام مطالعات هیستولوژی عموماً از روش اتوپسی استفاده می کنند.
زمانی که یک موجود می میرد، سلول ها از داخل دچار فرآیند اتولیز شده و طی آن تمام پروتئین های آن شکسته می شوند. از طرف دیگر باکتری هایی که به شکل طبیعی در فلور پوست و روده بودند فرصت آن را پیدا می کنند که سرتاسر بدن را گرفته و از آن تغذیه کنند. این دو مورد باعث از دست رفتن ساختار سلولی می شود.
هیستولوژی یک بافت، زمانی ارزش دارد که دستخوش تغییرات نشده و همان ظاهری را که در بدن موجود زنده داشته به شکل کامل حفظ کند. لذا روش اتوپسی باید خیلی سریع انجام شده و پس از استخراج بافت با اندازه مناسب به محلول ثبوتی منتقل شود.
محلول های ثبوتی طی واکنش های پیچیده و با اتصال به انتهای پروتئین ها مانع شکسته شدن ساختار سلولی می شوند. محلول ثبوتی مناسب باید سلول ها را سریعاً بدون هیچ تغییر ساختاری کشته و تثبیت نماید. از طرفی باید با قدرت نفوذ بالا سرتاسر بافت را فرا گرفته و اختلالی نیز در رنگ آمیزی ایجاد نکند.
یکی از معروف ترین محلول های ثبوتی که هم در سطح میکروآناتومی و هم سیتولوژیکی مورد استفاده قرار می گیرد، فرمالین 3.7 درصد بافری می باشد. این محلول کاربرد های بسیار گسترده‌ای در هیستولوژی داشته و از رقیق کردن فرمالین غلیظ 37 درصد با آب مقطر یا بافر فسفات سالین به دست می آید.
نمونه بدون تغییری به مدت حداقل 48 ساعت در محلول ثبوتی می ماند. سپس برای ادامه مراحل هیستولوژی در قطعات کوچک تر برش می خورد. برش زدن بافت باید به گونه‌ای انجام شود که آن سطح مورد برش با میکروتوم، یک سطح صاف داشته باشد.
در هیستولوژی برخی از بافت ها به دلیل ساختار سخت قابل برش با میکروتوم نیستند. مثال واضح یک بافت سخت، استخوان می باشد. استخوان به خاطر کلسیفیه شدن بسیار بالا با میکروتوم برش نمی خورد و برای حذف آن باید یک شبانه روز بیشتر در محلول ثبوتی همراه با اسید نیتریک 10 درصد قرار گیرد.
پس از تثبیت بافت و قطعه قطعه کردن آن، بافت در فرآیند پردازش قرار می گیرد. به این مرحله در هیستولوژی پاساژ بافتی نیز می گویند. در پردازش بافت، نمونه ابتدا در درجات صعودی الکل قرار گرفته و الکل خالص جایگزین آب داخل بافت می شود. سپس بافت در 2 تعویض زایلن قرار گرفته و زایلن یا همان گزیلول جایگزین الکل می شود. در نهایت بافت در 2 تعویض پارافین مذاب 60 درجه سانتی‌گراد قرار گرفته و پارافین جایگزین گزیلول می شود.
پس از اتمام مراحل پردازش هیستولوژی، از بافت قالب های بلوک پارافینی گرفته می شود. این قالب ها در Paraffin Embedding Cassette گرفته شده و برای برش با دستگاه میکروتوم آماده می شوند.
سپس بافت ها در دستگاه میکروتوم مخصوص هیستولوژی قرار گرفته و در ضخامت های مختلف برش می خورند. پس از برش گیری بافت ها طی مراحل Floating و Sliding بافت در حمام آب گرم 50 درجه سانتی گراد شناور شده و سپس لام‌گیری می شود.
در ادامه برای حذف پارافین اطراف بافت، لام به مدت نیم ساعت در آون 10 درجه سانتی‌گراد قرار گرفته و سپس وارد مرحله رنگ آمیزی می شود.
در رنگ آمیزی های مختلف هیستولوژی، مجموعه‌ای از مراحل قبل و بعد از رنگ آمیزی ثابت هستند. قبل از انجام رنگ آمیزی پارافین بافت با گزیلول حذف شده و با الکل آبدهی می شود.
همچنین بعد از رنگ آمیزی آب بافت با الکل حذف شده و سپس با زایلن شفاف سازی انجام می شود. در مرحله آخر که بافت رنگ آمیزی شده و وضوح مناسب برای مطالعه هیستولوژی را کسب کرده با استفاده از چسب های مخصوص مونت شده و لامل بر روی آن قرار می گیرد.
همچنین بخوانید:
- پیوند بافت چیست؟ نحوه انجام آن در حیوان مدل
- کارآموزی مهندسی بافت و پزشکی بازساختی
- کارآموزی کار با حیوانات آزمایشگاهی
نویسنده: مسعود سلطانی حلوائی
