وکتور pBR322: تعریف، ساختار، سایت‌ها و کاربردها

فهرست مطالب نمایش

وکتور pBR322 چیست؟

pBR322 یک وکتور کلونینگ (Cloning vector) رایج در اشریشیا کلی (E. coli) است و کاربردهای فوق العاده‌ای در کلونینگ دارد.

فرم کامل pBR322:

p = پلاسمید
B = Bolivar
R= Rodriguez
322 = نام عددی

وکتور pBR322 در سال 1977 در آزمایشگاه Herbert Boyer در دانشگاه کالیفرنیا، سانفرانسیسکو ساخته شد.
این وکتور یک پلاسمید سنتتیک (Synthetic) است و اولین پلاسمید مصنوعی بود که ساخته و به عنوان یک وکتور کلونینگ استفاده شد.
pBR322 یکی از پلاسمیدهایی است که بیشترین مطالعه روی آن انجام شده است.
طول آن 4362 جفت باز (Base pair) است.
به طور کامل توالی‌یابی شده است، یعنی کل توالی pBR322 شناخته شده و مورد مطالعه قرار گرفته است.
وزن مولکولی آن 10⁶ 83 دالتون (Dalton) است.

ساختار وکتور pBR322

مبدا همانندسازی
سایت‌های محدود کننده آنزیم
سایت‌های نشانگر قابل انتخاب

مبدا همانندسازی

مبدا همانندسازی در پلاسمید pBR322 به عنوان pMB1 شناخته می‌شود.
تعداد کپی این پلاسمید 15 تا 20 می‌باشد.

سایت‌های محدود کننده آنزیم

حدود 40 سایت محدود کننده مختلف روی ژنوم pBR322 وجود دارد.
تقریباً 11 محل محدود کننده مختلف در ناحیه مقاوم به تتراسایکلین (Tetracycline) وجود دارد.
در ناحیه مقاوم به آمپی‌سیلین (Ampicillin)، 9 سایت محدود کننده آنزیم‌های مختلف وجود دارد.
برخی از سایت‌های شناخته شده محدود کننده آنزیم عبارتند از: BamHI، HindIII، EcoRI، SaII و بسیاری دیگر.

سایت‌های نشانگر قابل انتخاب

دو سایت نشانگر قابل انتخاب یا ژن مقاوم در برابر آنتی‌بیوتیک، روی ژنوم این پلاسمید وجود دارد.

سایت مقاوم به آمپی‌سیلین: ژن آمپی‌سیلین برای بتالاکتاماز کدگذاری می‌کند، که می‌تواند برای غربالگری میکروارگانیسم‌ها زمانی که یک DNA خارجی وارد پلاسمید می‌شود، استفاده شود.
سایت مقاوم به تتراسایکلین: این ژن، آنتی‎بیوتیک تتراسایکلین را تجزیه می‌کند و می‌تواند برای غربالگری میکروارگانیسم‌ها استفاده شود.
این ژن‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک در غربالگری ارگانیسم‌ها پس از شبیه‌سازی مفید هستند.

غربالگری نوترکیب‌های حاوی pBR322

در نظر بگیرید که از آنزیم محدود کننده BamHI برای برش پلاسمید در آن موقعیت خاص استفاده می‌شود.
BamHI در ناحیه مقاوم به تتراسایکلین مربوط به پلاسمید pBR322 قرار دارد.
اکنون، مولکول نوترکیب pBR322 که شامل مولکول DNA تازه وارد شده است، به تتراسایکلین حساس خواهد بود.
اما این مولکول نوترکیب نسبت به آمپی‌سیلین مقاوم است، زیرا ژن مقاوم به آمپی‌سیلین کاملاً در حال عمل کردن می‌باشد.
از این رو سلول‌های نوترکیب روی محیط حاوی آمپی‌سیلین قرار می‌گیرند و انکوبه می‌شوند.
کلنی‌هایی که روی پلیت‌های حاوی محیط دارای آمپی‌سیلین ظاهر می‌شوند، کلنی‌های تبدیل‌شده حاوی سلول‌هایی با مولکول DNA تازه وارد شده، هستند.
برای تایید کلنی‌های تبدیل شده از تکنیک پلیت‌های همانند (Replica plate) استفاده می‌شود.
برای تأیید این‌که کلنی‌های روی محیط‌های حاوی آمپی‌سیلین، کلنی‌های تبدیل‌شده هستند، روی پلیت‌های حاوی محیطی شامل تتراسایکلین قرار می‌گیرند.
کلنی‌هایی که در محیط شامل تتراسایکلین رشد نمی‌کنند، کلنی‌های تبدیل‌شده هستند، زیرا کلنی‌های تبدیل‌شده به تتراسایکلین حساس هستند.

مزایای وکتور pBR322

با توجه به اندازه قابل کنترل آن، پلاسمید pBR322 به طور گسترده‌ای به عنوان یک وکتور کلونینگ استفاده می‌شود.
وجود دو ژن مقاوم به آنتی‌بیوتیک، فرآیند انتخاب نوترکیب‌ها را تسهیل می‌کند.
چند سایت محدود کننده آنزیم، پلاسمید را از بسیاری جهات سازگار می‌کند.
pBR322 تعداد کپی بالایی دارد که در مهندسی ژنتیک بسیار مطلوب است.