وکتور pUC19: تعریف، ساختار، سایت‌ها و کاربرد‌ها

فهرست مطالب نمایش

وکتور pUC19 چیست؟

پلاسمیدهای pUC اولین بار توسط Joachim Messing و همکارانش ساخته شدند. این پلاسمید یک وکتور کلونینگ (Cloning vector) رایج در باکتری E. coli است.

pUC19، 2686 جفت باز طول دارد. وزن مولکولی این وکتور 1.75×106 دالتون است. وکتور pUC19 یک پلاسمید کوچک با تعداد کپی ژنی بالا است. حاوی ژن lacz بوده و دارای چندین سایت کلونینگ است.

از این رو به طور گسترده‌ای به عنوان یک وکتور کلونینگ استفاده می‌شود. پلاسمید pUC19 از نظر ساختار شبیه پلاسمید pBR322 است.

فرم کامل pUC19

p = پلاسمید
UC = دانشگاه کالیفرنیا (University of California)
19 = تخصیص عددی

ساختار pUC19

pUC19 یک پلاسمید با طول 2686 جفت باز است.
منشا تکثیر: منشا تکثیر پلاسمید pUC19 از pMB1 مشتق شده است.
سایت‌های کلونینگ چندگانه: یک دنباله کوتاه 2.8 کیلو بازی وجود دارد که حاوی مکان‌هایی برای آنزیم‌های محدودکننده مختلف است. این امر باعث افزایش تعداد سایت‌های محدود کننده بالقوه در دسترس شده و تولید قطعه مورد نظر را برای کلونینگ ممکن می‌سازد.
نشانگرهای قابل انتخاب: پلاسمید pUC19 حاوی یک ژن مقاوم به آمپی‌سیلین (Ampicillin) است که می‌تواند برای غربالگری نوترکیب‌ها استفاده شود. این پلاسمید همچنین حاوی ژن lacZ مربوط به coli است که بتا-گالاکتوزیداز (β-galactosidase) را کد می‌کند (β-گالاکتوزیداز، لاکتوز را هیدرولیز می‌کند).
سایت‌های محدود کننده: وکتور pUC19 حامل سایت کلونینگ چندگانه (پلی لینکر (Poly-linker)) با طول 54 جفت باز است که حاوی 13 سایت مختلف اندونوکلئازهای (Endonuclease) محدودکننده خاص هگزانوکلئوتیدی (Hexanucleotide) است.

برخی از سایت‌های محدود کننده EcoR1، HindIII، BamH1 و غیره هستند.

غربالگری وکتور pUC19

روش غربالگری آبی-سفید (Blue-White screening method) برای وکتورهای pUC19 استفاده می‌شود. فرآیند غربالگری به شرح زیر است:

این روش غربالگری بر اساس این واقعیت است که رنگ‌دانه آبی زمانی تشکیل می‌شود که β-گالاکتوزیداز هیدرولیز یک ماده سنتتیک (Synthetic) به نام X-gal ((5-برومو-4-کلرو-3-ایندویل-β-D-گالاکتوپیرانوسید (5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactopyranoside)) را در محیط کاتالیز می‌کند.
هنگامی که X-gal هیدرولیز می‌شود، گالاکتوز و 5-برومو-4-کلرو-3-هیدروکسی ایندول (5-bromo-4-chloro-3-hydroxy indole) را ایجاد می‌کند.
محصول بعدی تحت دیمر شدن (Dimerization) (خود به خودی) و اکسیداسیون قرار می‌گیرد.
در نتیجه دیمر شدن و اکسیداسیون، رنگ‌دانه آبی تشکیل می‌شود.
سلول‌هایی که دارای فعالیت β-گالاکتوزیداز هستند، کلنی‌های آبی تشکیل می‌دهند، در حالی که سلول‌هایی که فعالیت بتا-گالاکتوزیداز را از خود نشان نمی‌دهند، کلنی‌های سفید رنگی روی محیط کشت آگار حاوی X-gal تشکیل می‌دهند.
سلول‌های نوترکیب که حاوی قطعات DNA تازه وارد شده هستند، فاقد فعالیت β-گالاکتوزیداز هستند و از این رو در پلیت‌های (Plate) آگار، سفید به نظر می‌رسند.
این روش غربالگری سلول‌های نوترکیب، ساده‌ترین و سریع‌ترین روش است.

مزایا

این وکتور یک وکتور کلونینگ کوچک است و کاربردهای صنعتی بزرگی دارد.
وکتور pUC19 یک فرآیند انتخاب یک مرحله‌ای برای نوترکیب‌ها دارد، از این رو در مقیاس بزرگ استفاده می‌شود.
این وکتور، تعداد کپی ژنی بالایی دارد.
وجود سایت‌های محدود کننده زیاد آن را برای کلونینگ مناسب می‌کند.

همچنین بخوانید:

منبع

مترجم: صادق حسینی‌کیا

از این مطلب چقدر راضی بودید؟

روی ستاره کلیک کنید تا نظرتون ثبت بشه