پروتئومیکس ۴ بعدی چیست؟

فهرست مطالب نمایش

چگونه پروتئین‌های با فراوانی کم را شناسایی کنیم؟

مطالعه سرم انسانی بخش مهمی از شناسایی نشانگرهای تشخیص و پایش بیماری بوده است. یکی از بزرگ‌ترین چالش‌ها این است که سرم خون پیچیده است. زیرا حاوی تعداد کمی پروتئین با فراوانی بالا است که غلظت آن‌ها می‌تواند بین افراد متفاوت باشد.

حدود 80 درصد از پروتئین‌های سرم ممکن است آلبومین باشد، که باعث می‌شود پروتئین‌های نشانگر بیماری مانند آنتی ژن اختصاصی پروستات پوشانده شوند. زیرا تنها در غلظت‌های پیکوگرم تا نانوگرم در میلی لیتر وجود دارند.

دانشمندان برای غلبه بر دشواری تجزیه و تحلیل پروتئین‌ها با فراوانی کم در نمونه‌ای که توسط چند پروتئین غالب است، پروتئینی را که بسیار فراوان است (آلبومین در مورد سرم) تخلیه می‌کنند. تانگ و همکاران یک روش پروتئومیکس با ترکیب چهار تکنیک جداگانه برای تجزیه و تحلیل پروتئین‌های سرم را شرح داد. به طور خلاصه، چهار مرحله عبارت بودند از:

کاهش پروتئین‌های اصلی
تمرکز ایزوالکتریک محلول در مقیاس میکرو
الکتروفورز ژل 1 بعدی SDS-پلی آکریل آمید
کروماتوگرافی مایع – طیف سنجی جرمی

هر یک از این تکنیک‌ها به عنوان “ابعاد” تعریف می‌شوند و بنابراین ترکیب این چهار تکنیک پروتئومیکس “پروتئومیکس 4 بعدی” نامیده می‌شود. تغییراتی در این مورد نیز ممکن است رخ دهد، به عنوان مثال، جداسازی پپتید تریپتیک RP نانو را می‌توان قبل از طیف سنجی جرمی به جای کروماتوگرافی مایع استفاده کرد.

کاهش پروتئین

تانگ و همکاران دریافتند که استفاده از آنتی بادی‌ها بهترین راه برای تخلیه پروتئین‌های فراوان به شیوه‌ای انتخابی است. نشان داده شد که ستون‌های ایمونوفینیتی حدود 98 درصد از پروتئین‌های پلاسما با فراوانی بالا را حذف می‌کنند در حالی که اکثر پروتئین‌ها با فراوانی پایین را حفظ می‌کنند.

این امر برای مطالعه پروتئین‌های با فراوانی کم ایده‌آل است، و روش‌هایی برای پلاسمای انسان و همچنین جانوران دیگر مانند موش و رت در دسترس است. این امر مفید بوده زیرا موش‌ها و رت‌ها اغلب به عنوان مدل‌های حیوانی برای مطالعه بیماری‌های انسانی و سمیت دارویی استفاده می‌شوند.

تمرکز ایزوالکتریک محلول در مقیاس میکرو

تمرکز ایزوالکتریک یک تکنیک الکتروفورز است که پروتئین‌ها را بر اساس نقطه ایزوالکتریک آن‌ها جدا می‌کند. جداسازی ایزوالکتریک محلول، که از غشاهای بافری بی‌حرکت استفاده می‌کند، توانایی جداسازی پروتئین‌ها را با وضوح بالا ارائه می‌دهد. زیرا می‌توان این غشاها را با توجه به مقادیر خاص pH تقسیم کرد. این امر اجازه می‌دهد تا پروتئین‌هایی که نقاط ایزوالکتریک آن‌ها تنها با تفاوت 0.01 واحد pH از هم جدا شوند.

تانگ و همکاران یک دستگاه فوکوس ایزوالکتریک با هفت محفظه را توسعه دادند که اکنون تجاری شده است. این دستگاه ظرفیت برای هفت نقطه ایزوالکتریک را با استفاده از هشت دیسک متحرک آکریل آمید فراهم می‌کند. این را می‌توان برای ارائه تنظیمات مختلف تغییر داد. در اینجا، سرمی که ابتدا از طریق یک ستون میل ترکیبی برای تخلیه پروتئین‌های فراوان اجرا شده بود، از طریق محلول ایزوالکتریک در مقیاس میکرو اجرا شد.

1D SDS-PAGE

الکتروفورز ژل سدیم دودسیل سولفات-پلی آکریل آمید می‌تواند یک مخلوط پروتئین را با توجه به اندازه‌های مربوط به پروتئین‌های درون آن جدا کند. در روش ابداع شده توسط تانگ و همکاران، پروتئین‌هایی که از طریق فرآیند تمرکز ایزوالکتریک در مقیاس میکرو اجرا شده بودند، در مرحله بعدی از طریق 1D SDS-PAGE اجرا شدند. این نه تنها امکان جداسازی پروتئین‌ها را می‌دهد، بلکه اجازه می‌دهد تا پروتئین‌های خاصی از تجزیه و تحلیل بیشتر حذف شوند.

به طور معمول، نمونه‌های پیچیده نیاز به زمان طولانی‌تری از طریق SDS-PAGE دارند تا پروتئین‌ها به خوبی جدا شوند. با این حال، اشاره به این نکته حائز اهمیت است که زمان اجرای طولانی‌تر ممکن است منجر به از دست دادن برخی از پروتئین‌های با وزن مولکولی کم شود، بنابراین اگر این پروتئین‌ها مورد توجه هستند، توصیه می‌شود زمان اجرا را کاهش دهید.

قبل از رفتن به مرحله بعدی، پروتئین‌ها توسط تریپسین هضم می‌شوند. تانگ و همکاران روشی را ابداع کردند که می‌توان آن را روی ژل SDS-PAGE انجام داد. در اینجا، ژل SDS-PAGE بریده می‌شود، سپس در یک صفحه 96 چاهکی قرار می‌گیرد. سپس تریپسین با ژل به چاهک‌ها اضافه می‌شود که پروتئین موجود در ژل را هضم می‌کند.

کروماتوگرافی مایع – طیف سنجی جرمی

این آخرین مرحله در روش پروتئومی 4 بعدی تانگ است. در حالی که توسعه در طیف سنجی جرمی وجود داشته است، برای تجزیه و تحلیل نمونه‌های پیچیده توصیه می‌شود که نمونه قبل از طیف سنجی جرمی جدا شود.

در اینجا، تانگ و همکاران استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا فاز معکوس (RP-HPLC) قبل از طیف سنجی جرمی را اجرا کردند. به این ترتیب پروتئین‌های هضم شده از ژل SDS-PAGE ابتدا از طریق RP-HPLC جدا می‌شوند و این پساب‌های جدا شده روی طیف سنج جرمی آنالیز می‌گردند.

همچنین بخوانید: