مقدمه‌ای بر کاربردهای فلوسایتومتری در هماتولوژی
فرآیندهای سلولی پیچیده هستند و از طریق سیگنال دهی پویا درون سلولی کنترل می‌شوند. برای درک بهتر این فرآیندها، از فلوسایتومتری برای فنوتیپ کردن سلول‌ها با اندازه‌گیری ابعاد آنها و سنجش فضای داخلی آنها به روشی ساده استفاده می‌شود.
فلوسایتومتری تکنیکی است که در هماتولوژی یا خون شناسی برای مرتب سازی سلول‌ها بر اساس اندازه و پیچیدگی آنها استفاده می‌شود. فلوسایتومتری از زمان شروع به کار خود در سال 1976، عملکردهای جدیدی پیدا کرده است. اکنون می‌تواند سلول‌ها را با رویکردهای مبتنی بر فلورسانس برای تجزیه و تحلیل حیات سلول و موارد دیگر مرتب کند.
فلوسایتومتری چگونه انجام می‌شود؟
ابتدا سلول‌هایی که هدف قرار می‌گیرند با استفاده از فرمالدئید، بی‌حرکت کردن پروتئین‌های و حفظ سیگنال های گذرا ، فیکس می‌شوند. سپس، سلول‌های فیکس شده بواسطه مواد شوینده نفوذ پذیر می‌شوند و اجازه عبور آنتی بادی‌ها را از فضای بین سلولی می‌دهند.
برای اطمینان از تشخیص موفقیت آمیز آنتی ژن، غلظت مشخص فرمالدئید و مواد شوینده حیاتی هستند و بستگی به ماهیت اپی توپ‌های هدف دارند.
پس از انجام این کار، کمیت سلول‌های خونی را می‌توان از طریق جریان نمونه و مایع غلاف تعیین کرد. این تکنیک به ما اجازه می‌دهد تا سلول‌ها را بر اساس اندازه و پیچیدگی‌شان طبقه‌بندی کنیم و حتی می‌توانیم مرحله تمایز سلول‌های در حال نوسان را مشخص کنیم.
جنبه دیگری از فلوسایتومتری خود را به عنوان مرتب سازی سلولی فعال شده با فلورسانس (FACs) نشان می‌دهد. این نوع فلوسایتومتری تخصصی در دهه 1960 برای ما آورده شد.
این روش به کاربر اجازه می‌دهد تا سلول‌های بیولوژیکی بسیاری را در یک مخلوط ناهمگن مرتب کند، که همه از طریق پراکندگی نور فلورسانس انجام می‌شود. در این تکنیک بررسی سلول‌ها یک به یک در یک زمان انجام می شود(تک به تک) و به خوبی کار می‌کند زیرا هر سلول ویژگی‌های پراکندگی نور خاص خود را دارد.
بدنه دستگاه فلوسایتومتر در مرحله اول، این سیستم سیال از ماژول‌های لیزری برای بررسی کردن یک نمونه استفاده می‌کند که نور را در ناحیه مرئی (380-700 نانومتر) ساطع می‌کند. محیط سلولی وارد شده به دستگاه، از مقابل لیزر عبور می‌کند که “نقطه ادغام” نامیده می‌شود. از اینجا، نور بر اساس خواص انکساری هر جزئی در سیتوپلاسم پراکنده می‌شود. اصلی که این دستگاه بر آن استوار است، تمرکز هیدرودینامیکی نامیده می‌شود.
در اینجا، غلاف سیال و هسته سیال در یک حرکت روان جریان دارند. غلاف سیال در جریان آرام جریان دارد در حالی که هسته سیال با فشار کمی بالاتر جریان می‌یابد. این به سلول‌های هدف اجازه می‌دهد تا در یک فایل واحد در جهت لیزر حرکت کنند و به دستگاه اجازه می‌دهد بر روی هسته مایع تمرکز کند.
لوله‌های فتومولتی‌پلایر اغلب آشکارساز انتخابی در فلوسایتومتری هستند که پراکندگی نور حاصل از نقطه ادغام را می‌خوانند. دو حالت نور مورد تجزیه و تحلیل عبارتند از پراکندگی رو به جلو و پراکندگی جانبی. این نور پراکنده به یک پالس ولتاژ تبدیل می‌شود که یک سیگنال آنالوگ قابل خواندن را در خود دارد.
هنگامی که این خوانش‌ها انجام شد، سیگنال آنالوگ از طریق یک واحد ADC به سیگنال دیجیتال تبدیل می‌شود و سپس بازخوانی دیجیتال نهایی می‌تواند بر روی مانیتور خوانده شود. بازخوانی حاصل به شکل یک هیستوگرام با تعداد سلول‌ها در محور y و سیگنال پراکندگی رو به جلو در محور x است.
سلول‌هایی با پیچیدگی یا دانه‌ریزی بالاتر، تمایل به پراکندگی نور بیشتری در زوایای متنوع‌تر دارند. این نشان می‌دهد که سلول‌های پیچیده‌تر منجر به پراکندگی جانبی بیشتری می‌شوند، در حالی که سلول‌های ساده‌تر پراکندگی بیشتری به جلو منتشر می‌کنند.
فلوسایتومتری در دنیای هماتولوژی در طول دهه‌ها، فلوسایتومتری در کاربردهای مختلفی مورد استفاده قرار گرفته است و زمینه‌های اپیدمیولوژی، ژنتیک و موارد دیگر را توضیح می‌دهد. اگر تصور شود که سلول‌ها غیرطبیعی یا آنئوپلوئیدی هستند، می‌توان از فلوسایتومتری برای تأیید محتوای DNA استفاده کرد.
هنگام استفاده از پروپیدیوم یدید به عنوان رنگ فلورسنت، می‌تواند در ساختار مارپیچ DNA دخالت کند. سیگنال فلورسنت حاصل متناسب با محتوای DNA در هسته خواهد بود و به دانشمندان این امکان را می‌دهد که میزان افزایش یا از دست دادن DNA را به صورت تجربی تعیین کنند.
برای تاکید بر اثربخشی این روش، می توان مقدار بیش از حد DNA موجود در سلول‌های تومور را تعیین کرد، با توجه به اینکه DNA آنوپلوئیدی اغلب با تومورهای بدخیم مرتبط است.
بر اساس این فرض، نه تنها می‌توان سرطان‌های بدخیم را تشخیص داد، بلکه می‌توان محل بالاترین غلظت سلول‌های آنیوپلوئیدی را شناسایی کرد و به طور مؤثری تشکیل تومور را مشخص کرد. فلوسایتومتری همچنین می‌تواند در زمینه‌های دیگر برای تشخیص و تعیین مقدار گلبول های قرمز جنین در خون مادر استفاده شود.
در حالی که این روش می‌تواند برای تشخیص بارداری استفاده شود، می‌توان از آن در” پیش بینی پزشکی “برای جلوگیری از خونریزی جنین-مادر (FMH) نیز استفاده کرد. این خونریزی زمانی است که گلبول‌های قرمز جنین به گردش خون مادر هجوم می‌آورند و منجر به عوارض مربوط به زنان-زایمان/تروما در دوران بارداری می‌شود.
فلوسایتومتری در آنالیز لکوسیت سالانه صدها هزار بیمار مبتلا به لوسمی و لنفوم تشخیص داده می‌شوند. برای تایید رادیوگرافی بو سی تی اسکن، ایمونوفنوتایپ لوسمی‌ها/لنفوم‌ها با استفاده از فلوسایتومتری انجام می‌شود.
اسمیر مغز استخوان (A) و اسمیر خون (B) که سلول‌های بلاست (Blast cell) متعددی را با سیتوپلاسم بازوفیل غیر گرانولار نحیف، هسته‌های گرد یا کمی نامنظم، کروماتین ریز و یک یا چند هسته پررنگ نشان می‌دهد.
این را می‌توان با طبقه بندی نشانگرهای سطح سلولی مختلف، مانند نشانگرهای CD، که در بین تمام نئوپلاسم‌های هماتولنفوئید یافت می‌شود، انجام داد. با بررسی بیشتر، می‌توان به طور سیستماتیک ماهیت لوسمی را بر اساس نشانگرهای CD شناسایی شده توسط فلوسایتومتر تشخیص داد.
به عنوان مثال، اگر نشانگرهای CD19/20/22 مثبت باشند، می‌دانیم که سرطان با سلول‌های B سیستم ایمنی مرتبط است. اگر CD5 و CD23 مثبت باشند، تشخیص لنفوم هوچکین است. اگر CD23 منفی و CD22 مثبت باشد، تشخیص لنفوم سلول mantle (سرطان خون نادر است که در گلبول های سفید خون در غدد لنفاوی شروع می شود) است.
اگرچه این ابزار چندین دهه قبل مونتاژ شده بود، علم مدرن راهی برای پیاده‌سازی روش‌های عملیاتی فلوسایتومترها در اشکال مختلف آنالیز پیدا کرده است.
همچنین بخوانید:
- دوره مهارت آموزی فلوسایتومتری
- دوره کارآموزی هماتولوژی
- ایمونوسیتوفلورسنت و آشنایی با فلوسایتومتری
- استفاده از فلوسایتومتری برای تشخیص PIDs
- فلوسایتومتری در تشخیص بیماری
