مقدمه‌ای بر فلوسایتومتری
فلوسایتومتری یک روش تحلیلی است که به سلول‌ها اجازه می‌دهد تا در حین عبور از یک فایل به سرعت توسط لیزر آنالیز و دسته‌بندی شوند. روشی که در آن نور لیزر پراکنده می‌شود می‌تواند برای استنباط درجه ای از اطلاعات در مورد سلول مانند اندازه، پیچیدگی داخلی و دانه بندی سلول استفاده شود، در حالی که شناسایی ساختار خاص تر را می‌توان با ترکیب فلوروفورها و میکروسکوپ فلورسنت در فرآیند به دست آورد.
سایر روش‌های مشخصه‌سازی مانند طیف‌سنجی جرمی ممکن است مستقیماً در تجهیزات فلوسایتومتری گنجانده شوند تا بتوان خصوصیات دقیق‌تری را تشخیص داد.
فلوسایتومتری در شناسایی هدف
فلوسایتومتری در هر مرحله از فرآیند کشف دارو، از شناسایی هدف تا توسعه ، استفاده می‌شود. اهداف دارویی معتبر در سلول ها تقریباً کل ساختارهای بیومولکولی موجود را در بر می‌گیرند مانند: غشای سلولی، هر پروتئینی که در عملکرد مکانیکی یا سیگنال دهی دخیل است، DNA تا سطح ژن، و سایر مولکول های کوچکتر مانند mRNA.
مشخص کردن جمعیت‌های سلولی بزرگ و متنوع به روشی با توان بالا در شناسایی اولیه هدف مفید است و به سلول‌های ناکارآمد (بیمار) اجازه می‌دهد تا برای تجزیه و تحلیل عمیق‌تر با تکنیک‌های دیگر جدا شوند. این فرآیند را می‌توان با برچسب گذاری ویژگی های مولکولی درون سلولی که مشکوک به درگیر شدن در بیماری با پروب های فلورسنت هستند، بهینه کرد و به این ترتیب، ویژگی های ساختاری سلول مانند فراوانی یک پروتئین خاص یا یکپارچگی غشای سلولی را می‌توان به سرعت ارزیابی کردو تشخیص داد.
پس از شناسایی هدف ، اثربخشی و سمیت دارو را می‌توان با فلوسایتومتری بررسی کرد. می‌توان به سرعت این نتایج را با شمارش سلولی با توان بالا استنتاج کرد، اگرچه سلول ها اغلب بر اساس مرحله‌ای از آپوپتوز که در آن قرار دارند مرتب می‌شوند.
در میان چندین روش دیگر که فعال شدن مکانیسم های سلولی خاص را مشخص می‌کند، آپوپتوز را می توان با استفاده از پروتئین فلوروفور انکسین V، که به فسفولیپید فسفاتیدیل سرین متصل می‌شود، بررسی کرد. این جزء از غشای سلولی در مراحل اولیه آپوپتوز با غلظت بالایی به سطح سلول می‌آید و به سلول‌هایی که سمیت ناشی از درمان با داروی تحت بررسی را تجربه می‌کنند، اجازه می‌دهد شناسایی شوند.
کاربرد فلوسایتومتری در کشف دارو
به طور مشابه، سلول‌هایی که دچار آپوپتوز دیررس می‌شوند را می‌توان با ساختار غشایی نشت کرده آن‌ها شناسایی کرد و بنابراین انواع فلوروفورها که برای نفوذ به غشای دست نخورده مشکل دارند اما با ساختارهای سلولی داخلی مانند DNA پیوند برقرار می‌کنند، اغلب برای مشخص کردن این سلول‌ها استفاده می‌شوند. پروپیدیوم یدید یکی از این رنگ های متصل شونده به DNA است که می‌تواند برای تمایز بین مراحل چرخه سلولی که سلول در حال حاضر در آن قرار دارد نیز استفاده شود.
سلول‌های فاز G2 یا M تنها یک کپی از DNA دارند، در حالی که سلول‌هایی که در فاز G0 یا G1 تحت میتوز قرار می‌گیرند، دو نسخه دارند و بنابراین می‌توان از شدت فلورسانس برای سنجش این مرحله استفاده کرد. بسته به اینکه چه نوع سلولی مورد تجزیه و تحلیل به عنوان هدف درمان در نظر گرفته شود، مکث در چرخه سلولی می‌تواند نشان دهنده اثربخشی یا سمیت دارو باشد.
هدف یک ترکیب دارویی اغلب ایجاد اختلال یا تقویت پیوند به یک هدف خاص و بین مولکول‌های خاص است و بنابراین شدت فلورسانس شناسایی شده از سلول به خوبی با برهمکنش‌های بین ترکیبات لیبل شده مورد نظر و هدف خاص در سلول ارتباط دارد.آزمایش طیف وسیعی از سلول‌ها در شرایط آزمایشگاهی مختلف و آنالیز توسط فلوسایتومتری همچنین به محققان کمک می‌کند تا آزمایش‌های بهینه in vivo را که بعداً انجام می‌شوند، بررسی کنند و با شناسایی سلول‌هایی که در معرض آپوپتوز یا توقف چرخه سلولی قرار دارند، به اثر سمیت دارو توجه ویژه‌ای داشته باشند.
کاربردهای آینده
فلوسایتومتری همچنین برای مطالعه کارایی و ایمنی واکسن در تعدادی از ظرفیت‌ها، مانند تعیین کمیت بار ویروسی، شناسایی آنتی‌بادی‌های IgG و IgM، و اندازه‌گیری پاسخ‌های سلول‌های T و B استفاده می‌شود.
در نمونه ای از مورد دوم، پاسخ سلول های T CD4+ و CD8+ افراد واکسینه شده علیه پپتیدهای SARS-CoV-2 در افراد واکسینه شده توسط Ewer و همکاران ارزیابی شد. (2020) با استفاده از فلوسیتومتری، که در آن سلول ها ابتدا با ترکیبی از آنتی بادی های پروتئین سطح سلول T ضد انسانی و سایتوکاین های ضد انسانی رنگ آمیزی شدند.
وجود پروتئین‌های دخیل در فعال‌سازی سلول‌های T و ترشح سایتوکاین‌های التهابی، شواهدی از کارآیی واکسن است، و ماهیت پرتوان فلوسایتومتری برای چنین کاربردهایی از زمان شیوع همه‌گیری COVID-19 بسیار مفید است.
فلوسایتومترهای پیشرفته مدرن که در صنعت داروسازی استفاده می شوند، قادر به پردازش ده ها هزار سلول در ثانیه به روشی کاملاً خودکار هستند، اگرچه زمانی که انجام درجات بالاتر تجزیه و تحلیل خصوصیات به طور چشمگیری کندتر است.
بیوراکتورهایی که به طور مداوم کار می کنند سلول هایی را برای آزمایش تولید می‌کنند که می‌توانند در معرض شرایط مختلف قرار گیرند و بعداً توسط فلوسایتومتری طبقه بندی شوند.
افزایش اتوماسیون، سرعت پردازش سلولی، و انواع تکنیک های مشخص که مستقیماً در تجهیزات فلوسایتومتری گنجانده شده اند، احتمالاً در آینده مشاهده خواهند شد.
علاوه بر بهبود کارایی و در نتیجه بالا رفتن دقت، از آنجایی که تعداد بیشتری از سلول‌ها را می‌توان با جزئیات آزمایش و تجزیه و تحلیل کرد، این امر همچنین اجازه می‌دهد تا پروفایل‌های ایمنی قوی‌تری برای ترکیبات جدید با تنوع بیشتری از سلول‌های آزمایش شده در شرایط موردنظر ایجاد شود.
مطالب مرتبط:
مترجم: نسترن عاشوری
