تکنیک ها
کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (HPLC) چیست؟
کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (HPLC)
کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (HPLC) نوعی کروماتوگرافی ستونی است که مخلوط نمونه یا آنالیت را در یک حلال (معروف به فاز متحرک) با فشار زیاد از طریق یک ستون با مواد بسته بندی کروماتوگرافی (فاز ساکن) پمپ می شود. نمونه توسط یک جریان حامل گاز هلیوم یا نیتروژن حمل می شود. HPLC توانایی جداسازی و شناسایی ترکیباتی را دارد که در هر نمونه وجود دارد و می تواند در مایع با غلظت کمی به اندازه قطعات در تریلیون حل شود. به دلیل همین قابلیت پذیری ، HPLC در انواع کاربردهای صنعتی و علمی مانند دارویی ، زیست محیطی ، پزشکی قانونی و مواد شیمیایی مورد استفاده قرار می گیرد.
زمان ماند نمونه بسته به فعل و انفعال بین فاز ساکن ، مولکولهای مورد تجزیه و تحلیل و حلال یا حلالهای استفاده شده متفاوت خواهد بود. همانطور که نمونه از ستون عبور می کند ، با سرعت متفاوتی بین دو مرحله تعامل می کند ، در درجه اول به دلیل قطب های مختلف در آنالیت ها. آنالیت هایی که کمترین میزان تعامل با فاز ساکن یا بیشترین میزان تعامل با فاز متحرک را دارند ، سریعتر از ستون خارج می شوند.
اجزای اصلی در سیستم HPLC شامل مخزن حلال یا چندین مخزن ، پمپ فشار قوی ، ستون ، سیستم انژکتور و تشخیص دهنده است.
مخزن، حلال را در خود نگه می دارد ، که به دلیل حرکت آن فاز متحرک نامیده می شود. در سیستم معمولاً حداقل دو مخزن وجود دارد که هر کدام حداکثر 1000 سی سی حلال را در خود نگه می دارد و معمولاً با یک دیفیوزر گاز مجهز می شود که از طریق آن می توان هلیوم را منتقل کرد. از پمپ برای تولید جریان مشخصی از فاز متحرک استفاده می شود. اگرچه تزریق دستی نمونه ها هنوز امکان پذیر است ، اکنون بیشتر HPLC ها کاملاً خودکار و توسط رایانه کنترل می شوند. انژکتور یا نمونه گیر اتوماتیک ، حلال را به یک جریان فازی وارد می کند که نمونه را به ستون فشار بالا (تا 400 بار) می رساند ، که شامل مواد بسته بندی مخصوصی است که برای جداسازی لازم است. از مواد بسته بندی به عنوان فاز ساکن یاد می شود زیرا توسط سخت افزار ستون در جای خود نگه داشته می شود.
برای دیدن نوارهای ترکیبی جدا شده هنگام خارج شدن از ستون فشار بالا ، به یک ردیاب نیاز است. اطلاعات از آشکارساز به رایانه ای که کروماتوگرام تولید می کند ارسال می شود. فاز متحرک که از آشکارساز خارج می شود، یا به زباله ارسال شده و یا به دلخواه جمع می شود.
پاشش هلیوم یک روش موثر برای گاززدایی فاز متحرک برای جلوگیری از خطوط پایه ناپایدار ناشی از هوای محلول است. از نیتروژن به عنوان گاز نبولایزاسیون در آشکارساز پراکندگی نور تبخیری (ELSD) استفاده می شود که در آن حلال از نمونه تبخیر می شود و همانطور که اندازه گیری می شود غبار ایجاد می کند.
کروماتوگرافی مایع با عملکرد فوق العاده بالا (uHPLC)
در مواردی که HPLC استاندارد معمولاً از ذرات ستون با اندازه های 3 تا 5 میکرومتر و فشارهای حدود 400 بار استفاده می کند ، uHPLC از ستون های مخصوص طراحی شده با اندازه ذرات تا 1.7 میکرومتر در فشارهای بیش از 1000 بار استفاده می کند. مزیت اصلی uHPLC سرعت است. این سیستم ها سریع تر ، حساس تر هستند و به حجم کمتری از حلال های آلی نسبت به HPLC استاندارد متکی هستند ، در نتیجه توانایی اجرای نمونه های بیشتر در زمان کمتری وجود دارد. با این وجود ، اگر سیستم ها در فشارهای معمول بیش از 800 بار کار کنند ، ستون ها زودتر از بین می روند یا تخریب می شوند. فناوری جدیدی برای واحدهای uHPLC در حال استفاده است تا از ذرات ستون با اندازه 1 میکرومتر و پتانسیل فشار تا 6800 بار استفاده کنند.
کروماتوگرافی مایع پروتئین سریع (FPLC)
FPLC سیستمی مشابه کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا است که برای جداسازی یا تصفیه پروتئین ها و سایر مولکول های زیستی از مخلوط های پیچیده استفاده می شود. تفاوت اصلی بین FPLC و HPLC فشار کاری استاندارد است. ستون های FPLC فقط تا حداکثر فشارهای 3-5 مگاپاسکال قابل استفاده هستند. اگر فشار HPLC محدود شود ، تقریباً هر ستون FPLC نیز می تواند در سیستم HPLC استفاده شود.
