مقدمه‌ای بر کروموزوم‌های مصنوعی
کروموزوم‌های مصنوعی فقط یک شکل مصنوعی از کرومزوم نیستند، بلکه ابزاری ارزشمند برای تحقیقات و کاربردهای درمانی بالقوه هستند.
این‌ها نسخه‌های کوچک‌شده کروموزوم‌های واقعی هستند که می‌توانند خود را در سلول‌های میزبان تکثیر کنند. درست مانند کروموزوم‌های طبیعی، به شیوه‌ای پایدار اما غیر یکپارچه، برای وارد کردن ژن‌های بزرگ یا چندین ژن به سلول پستانداران یا گیاهان سازمان‌یابی شده‌اند.
کروموزوم‌های مصنوعی- نیازها
از نظر ساختاری، کروموزوم‌های مصنوعی مولکول‌های DNA با ترکیب شناخته شده هستند که با ترکیب خاص، کروموزومی مانند کروموزوم طبیعی را سنتز می‌کنند.
یکی از مزیت‌های اصلی کرومزوم مصنوعی، استفاده آن‌ها در ویرایش ژن است. در واقع محققان از این کرومزوم‌ها زمانی استفاده می‌کنند که بخواهند یک قطعه DNA به بزرگی بیش از ۱۰۰ کیلوباز را ویرایش کنند. این قطعه یک مسیر بیوسنتزی کامل حاوی آنزیم‌های متعدد را رمزگذاری می‌کند و باید به یک کروموزوم اضافه شود.
ابزار قدرتمند ویرایش ژن CRISPR-Cas9، برای ایجاد تغییرات دقیق و خاص در ژنوم مفید است. اما نمی‌تواند بخش‌های کامل DNA را وارد کند. اینجاست که کروموزوم‌های مصنوعی وارد عمل می‌شوند. آن‌ها به اندازه‌ای بزرگ هستند که می‌توانند، حتی ژن عظیم دیستروفین با 2.4 میلیون نوکلئوتید را در خود جای دهند.
اولین کروموزوم مصنوعی
در سال 2014، ژنتیک‌دانان برای اولین بار شروع به ساخت یک کروموزوم مخمری سفارشی از مخمر ساکارومایسس سرویزیه کردند.
آن‌ها با استفاده از تکنیک‌های DNA نوترکیب، پلاسمید حلقوی را با یک سانترومر مخمر، منشاء همانندسازی، یک ژن نشانگر و دو امتداد DNA تلومر پالیندرومی مونتاژ کردند. سپس آن را در مخمر وارد کردند، جایی که به یک مولکول خطی ساده تبدیل شد.
این پلاسمیدها سپس با هر چرخه میتوز سلولی با دقت بیش از 99 درصد تکثیر و جدا شدند و حداقل به اندازه 20 نسل در کشت‌های در حال تقسیم نگهداری شدند.
با درک اینکه چگونه ژن‌های درون یک کروموزوم با هم کار می‌کنند تا ملزومات زندگی و متابولیسم طبیعی را تولید کنند، محققان امیدوار بودند که بتوانند کروموزوم‌های گیاهی و حیوانی و حتی کروموزوم‌های مصنوعی انسان را بسازند.
با این حال، ساختن کروموزوم‌های مصنوعی پستانداران بسیار دشوارتر است، به همان دلایلی که ساخت کروموزوم‌های مصنوعی مخمر آسان‌تر بود.
این دلایل عبارتند از:
- هر یک از 3 دنباله برای عملکرد کروموزوم مخمر به خوبی مشخص شد.
- کارآمدی و رشد سریع مخمر سرعت و کنترل را تسهیل می‌کند.
- مخمرها کروموزوم‌های کوچکی دارند که راحت تر سازمان می‌یابند.
ایجاد کروموزوم مصنوعی
با افزایش دانش، اکنون راه‌های مختلفی برای ایجاد کروموزوم‌های مصنوعی وجود دارد. این‌ها همگی بر اساس بازسازی سانترومر و تلومر عملکردی پستانداران و در عین حال امکان تغییرات را فراهم می‌سازند:
- عناصر تعریف شده (تلومرها، مبدا همانند سازی، و سانترومرها) با هم به یک رده سلولی برای تشکیل یک کروموزوم مصنوعی ترانسفکت می‌شوند.
- کروموزوم‌های سلول میزبان تا سطح مینی کروموزوم‌ها، با حذف و قرار دادن دقیق تلومرها شکسته می‌شوند.
- تقویت هدفمند توالی‌های پری سانترومر و به دنبال قطعه قطعه شدن، برای ایجاد کروموزوم‌های تقویت شده با DNA ماهواره‌ای (SATAC)
یکی از انواع روش SATAC کروموزوم مصنوعی ACE است که از 50 نسخه یا بیشتر از 245 جفت باز توالی پذیرنده نوترکیبی باکتریوفاژ attP تشکیل شده است. این می‌تواند به رده های سلولی پستانداران متعدد ترانسفکت شده و برای دوره‌های طولانی نگهداری شود و اجازه تولید آن را می‌دهد. درون این سلول‌ها قرار گرفته و به آسانی خالص شوند. این سیستم همچنین حاوی بردارهای هدف گیری ACE و اینتگراز ACE است.
موانع سانترومر
بزرگترین مانعی که دانشمندان در این زمینه با آن روبرو هستند، پیچیدگی ایجاد سانترومرها است. ناحیه‌ای از کروموزوم که برای فرآیند تکثیر و تقسیم سلولی اساسی است.
مشخصه تعیین کننده سانترومر، پروتئینی به نام هیستون CENP-A است که برای اتصال به دوک‌های میتوزی ضروری است.
به گفته آلینا چان، دانشمند دانشگاه هاروارد، مشکل این است که «سانترومرها به خوبی تعریف نشده‌اند. ما اندازه مورد نیاز را نمی‌دانیم. نیازهای توالی ژنتیکی مبهم باقی می‌مانند، و ما فقط چند پروتئین را می‌شناسیم که می‌توانند به ایجاد یک سانترومر جدید کمک کنند.
رویکردهای مختلفی برای مقابله با این مشکل اتخاذ شده است.
در یکی از روش‌ها، محققین برای شبیه‌سازی این فرآیند، «props» را می‌سازند. سانترومرها توسط توالی‌های DNA آلفا-ماهواره (در انسان) احاطه شده‌اند، که اغلب دارای جایگاه‌های اتصال CENP-B هستند (CENP-B بارگذاری CENP-A را در کروموزوم مصنوعی جدید اعمال می‌کند).
بنابراین، دانشمندان DNA ماهواره‌ای α و محل‌های اتصال CENP-B را در DNA شبیه‌سازی و آن را به کروموزوم مصنوعی انسان تبدیل کنند. با این حال، این یک فرآیند ناکارآمد است و اغلب هیچ DNA سانترومری در محصول نهایی وجود ندارد.
روش دیگر، بارگذاری اولیه کروموزوم‌های مصنوعی مخمر با بیش از 100 کیلوبایت DNA آلفا ستلایت از سانترومر کروموزوم 21 با DNA تلومری و ژن‌های مارکر از ژنوم انسان، قبل از تبدیل آن‌ها به سلول‌های انسانی است. در این‌جا دوباره، DNA به کروموزوم‌های کوچک پایدار که هیچ توالی میزبانی نداشتند، مونتاژ شد.
مسائل فنی
این تکنیک‌ها مشکلاتی دارند: اولاً، کروموزوم‌های جدید هیچ ارتباط قابل پیش بینی با DNA وارد شده ندارند. ثانیا، بازآرایی‌های جدید ممکن است کروموزوم‌های جدیدی را تشکیل ندهند. در عوض، این می‌تواند باعث شود تلومرها در کرومزوم میزبان به عنوان جهش زا عمل کنند.
ثالثاً، تعداد بسیار کمی از مینی کروموزوم‌های کارامد و تنها در یک نوع سلول انسانی، سلول‌های فیبروسارکوم HT1080 تشکیل می‌شوند.
راه حل های دیگر
در میان فرآیندهای جدیدی که برای غلبه بر این موضوع مورد مطالعه قرار می‌گیرد، یک رویکرد امیدوارکننده، به کارگیری CENP-A در DNA شبیه سازی شده با استفاده از پروتئین همجوشی است. اولین گام این است که یک قطعه تکرار شونده از DNA به نام LacO با یک توالی 27 جفت باز در بخشی از مولکول DNA برای تشکیل سانترومر لازم است، ترکیب کنید.
سپس این DNA به سلول‌های انسانی وارد می‌شود که برای بیان پروتئین همجوشی ساخته شده‌اند. در میان چیزهای دیگر، حاوی یک محل اتصال برای LacO و پروتئین HJURP است که CENP-A را در کروماتین قرار می‌دهد.
پروتئین فیوژن از طریق دامنه اتصال LacO خود به توالی‌های LacO روی DNA معرفی‌شده متصل می‌شود. در حالی که همزمان CENP-A را در توالی‌های کروماتین داخل و نزدیک آن قسمت از کروموزوم مصنوعی از طریق پروتئین HJURP جذب می‌کند.
این CENP-A اکنون آماده تشکیل یک سانترومر است. بنابراین DNA شبیه سازی شده را به ساختاری پایدار و خود همانندساز تبدیل می‌کند که می‌توان آن را کروموزوم مصنوعی نامید.
موارد دیگر عبارتند از حصول اطمینان از بیان و تنظیم ژن‌های بزرگ حتی در هنگام قرار دادن آن‌ها در کروموزوم مصنوعی انسان که باید هر بار که سلول تقسیم می‌شود تکثیر و جدا شود.
فرآیند انتقال به خودی خود یک فرآیند دشوار است و محققان در حال بهبود آن و همچنین خود کروموزوم‌های مصنوعی انسان هستند.
همچنین بخوانید:
مترجم: شقایق مرتاضی
