توالی یابی امپلیكون: اصول، فرایند، انواع و کاربردها

فهرست مطالب نمایش

توالی یابی امپلیكون چیست؟

توالی یابی امپلیكون روشی برای توالی یابی است که مناطق ژنومی خاص یا مناطق محافظت شده در موجودات را هدف قرار می‌دهد تا آن‌ها را مشخص کرده و تغییرات ژنتیکی را مطالعه کند.

برخلاف توالی یابی کل ژنوم که کل ژنوم را پوشش می‌دهد، توالی یابی امپلیكون به صورت انتخابی مناطق مورد نظر را تکثیر و توالی یابی می‌کند، با استفاده از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR). PCR مناطق هدف DNA را تکثیر کرده و چندین نسخه از DNA هدف به نام امپلیكون تولید می‌کند. توالی یابی امپلیكون این یک روش توالی یابی هدفمند است و به طور گسترده برای شناسایی واریانت‌های ژنتیکی، مطالعه تنوع میکروبی و تشخیص پاتوژن‌ها در نمونه‌های بالینی استفاده می‌شود. با تمرکز بر مناطق خاص مورد نظر، فرایند توالی یابی کارآمدتر و هدفمند می‌شود. این امر امکان مطالعه دقیق مناطق خاص را بدون نیاز به توالی یابی کل ژنوم فراهم می‌کند.

اصل توالی یابی امپلیكون

توالی یابی امپلیكون بر اساس اصل توالی یابی مناطق خاص DNA مورد نظر که با استفاده از PCR تکثیر شده‌اند کار می‌کند. پرایمرهای الیگونوکلئوتیدی خاص برای تکثیر مناطق ژنومی خاص مورد نظر طراحی می‌شوند. سپس این مناطق با استفاده از PCR تکثیر می‌شوند تا قطعات کوتاه و خاص DNA به نام امپلیكون تولید شود که سپس با استفاده از فناوری‌های توالی یابی پر بازده توالی یابی می‌شوند.

این روش بسیار هدفمند تضمین می‌کند که فقط مناطق مورد نظر توالی یابی می‌شوند و حساسیت بالایی برای مشخص کردن ارگانیسم‌ها و تشخیص واریانت‌های ژنتیکی فراهم می‌کند. فرآیند توالی یابی امپلیكون شامل استخراج مناطق ژنتیکی مورد نظر، غنی سازی مناطق انتخاب شده با PCR، افزودن آداپتورها، ایجاد کتابخانه‌ها و سپس جمع‌آوری چندین نمونه برای توالی یابی در یک مرحله است.

فرایند/مراحل توالی یابی امپلیكون

آماده سازی نمونه و استخراج DNA

آماده سازی نمونه و استخراج DNA اولین مرحله آماده سازی نمونه است که با جمع آوری نمونه و استخراج DNA از نمونه‌های مورد نظر آغاز می‌شود. DNA را می‌توان با استفاده از روش‌های مختلف از جمله لیز شیمیایی و روش‌های مکانیکی استخراج کرد. در ابتدا سلول‌ها برای آزادسازی DNA لیز می‌شوند و سپس بقایای سلولی از مخلوط جدا می‌شود تا DNA از سایر آلاینده‌ها جدا شود. پس از آن مراحل خالص سازی، رسوب گذاری و بازسازی انجام می‌شود تا در نهایت DNA خالص مورد نظر به دست آید.

تکثیر PCR

فرایند PCR شامل چندین چرخه دناتوراسیون، اتصال پرایمر و طویل سازی (elongation) برای تکثیر مناطق مورد نظر DNA است. پرایمرهای اختصاصی برای مناطق ژنومی مورد نظر طراحی می‌شوند که مناطق ژنومی هدف را تکثیر کرده و امپلیكون تولید می‌کنند. این پرایمرها همچنین بارکدهای لازم برای شناسایی امپلیكون‌های نمونه‌های مختلف در طول توالی یابی را اضافه می‌کنند.

این مرحله تکثیر برای غنی سازی مناطق مورد نظر جهت افزایش حضور آن‌ها در داده‌های نهایی ضروری است. پس از تکثیر، محصولات PCR برای حذف هرگونه پرایمر واکنش نداده، دایمرهای پرایمر، نوکلئوتیدها و سایر آلاینده‌ها خالص سازی می‌شوند تا اطمینان حاصل شود که فقط امپلیكون‌های با کیفیت بالا توالی یابی می‌شوند.

ساخت کتابخانه

پس از تکثیر، مرحله بعدی شامل افزودن آداپتورهای توالی یابی به امپلیكون‌ها و ساخت کتابخانه‌ها برای آماده سازی DNA برای توالی یابی است.

آداپتورها برای فرآیند توالی یابی ضروری هستند زیرا به امپلیكون‌ها اجازه می‌دهند تا به سلول جریان توالی یابی متصل شوند. پس از افزودن آداپتورها، باید کتابخانه‌ها را بررسی کرد تا از اتصال صحیح آداپتور اطمینان حاصل شود. الکتروفورز ژل را می‌توان برای بررسی اندازه و خلوص محصولات تکثیر شده و تأیید حضور امپلیكون‌های هدف استفاده کرد.

توالی یابی

پس از آماده سازی کتابخانه‌ها، آن‌ها آماده توالی یابی هستند. این مرحله شامل بارگذاری کتابخانه‌ها بر روی یک پلتفرم توالی یابی است. پلتفرم‌های توالی یابی مانند Illumina HiSeq، MiSeq و PacBio را می‌توان برای توالی یابی امپلیكون‌ها استفاده کرد.

پلتفرم‌های Illumina به طور گسترده برای توالی یابی امپلیكون استفاده می‌شوند.

HiSeq توالی یابی با توان بالا ارائه می‌دهد و برای پروژه‌های بزرگ مقیاس مناسب است اما زمان پردازش طولانی‌تری دارد.

از سوی دیگر، MiSeq یک گزینه مقرون به صرفه‌تر و سریع‌تر برای پروژه‌های توالی یابی کوچک مقیاس است.

آنالیز داده

مرحله نهایی، آنالیز بیوانفورماتیکی داده‌های توالی یابی است

واکنش توالی یابی خوانش‌هایی تولید می‌کند که در فایل‌های FASTQ ذخیره می‌شوند که برای جداسازی نمونه‌ها بر اساس بارکدها و حذف بارکدها با استفاده از ابزارهایی مانند sabre جدا می‌شوند

سپس بازهای با کیفیت پایین، آداپتورها و آلاینده‌ها با استفاده از ابزارهایی مانند Trimmomatic فیلتر و برش داده می‌شوند

سپس توالی‌های یکسان ادغام شده و داپلیکیتها (duplicates) (نسخه هایی که شبیه به هم هستند ) با استفاده از حذف duplicates حذف می‌شوند.

در طول تکثیر PCR، قطعات از توالی‌های DNA مختلف می‌توانند به طور نادرست به هم بپیوندند

حذف کایمرا (Chimera removal) چنین توالی‌های کایمرایی (Chimera sequences) را شناسایی و حذف می‌کند

سپس توالی‌ها بسته به گردش کار انتخاب شده یا در واحدهای طبقه‌بندی عملیاتی (OTU) خوشه‌بندی می‌شوند یا به واریانت‌های توالی امپلیكون با وضوح بالا(high-resolution Amplicon Sequence Variants) (ASV) تبدیل می‌شوند

خروجی‌های استاندارد شامل جداول شمارش، فایل‌های FASTA و انتساب طبقه‌بندی تولید می‌شوند

انتساب طبقه‌بندی شامل طبقه‌بندی توالی‌ها بر اساس اطلاعات فیلوژنی آن‌ها با استفاده از پایگاه‌های داده مرجع است

سپس، تجزیه و تحلیل تنوع، تنوع آلفا و تنوع بتا را با استفاده از معیارهای مختلف مانند غنای گونه‌ای، یکنواختی، عدم تشابه و تنوع فیلوژنتیکی مطالعه می‌کن

تنوع آلفا تنوع را در یک نمونه واحد اندازه‌گیری می‌کند در حالی که تنوع بتا تفاوت‌ها بین نمونه‌ها را مقایسه می‌کند.

این کار با استفاده از ابزارهایی مانند phyloseq و DESeq2 انجام می‌شود.

انواع توالی یابی امپلیكون

بر اساس توالی‌های هدف برای توالی یابی، توالی یابی امپلیكون را می‌توان به 3 نوع تقسیم کرد:

توالی یابی 16S rRNA

توالی یابی 16S rRNA شامل توالی یابی ژن 16S rRNA است که در پروکاریوت‌ها وجود دارد.
این روش پرکاربردترین روش برای شناسایی و مطالعه باکتری‌ها و آرکیا است.
این توالی شامل مناطق متغیر و مناطق محافظت شده است. مناطق محافظت شده محل‌های اتصال برای پرایمرها در مرحله تکثیر PCR را فراهم می‌کنند و اطمینان حاصل می‌کنند که فرآیند تکثیر بر روی ژن مورد نظر متمرکز است. مناطق متغیر حاوی توالی‌های منحصر به فردی هستند که بین گونه‌های مختلف متفاوت هستند و اطلاعات لازم برای شناسایی و طبقه‌بندی دقیق را فراهم می‌کنند.

توالی یابی 18S rRNA

توالی یابی 18S rRNA ژن 18S rRNA خاص ارگانیسم‌های یوکاریوتی را هدف قرار می‌دهد و شامل مناطق محافظت شده و متغیر است.
ارگانیسم‌های یوکاریوتی را می‌توان با هدف قرار دادن این ژن شناسایی و طبقه‌بندی کرد.
مناطق محافظت شده اطمینان حاصل می‌کنند که پرایمرها به طور موثر متصل می‌شوند، در حالی که مناطق متغیر تمایز لازم برای تشخیص گونه‌های مختلف یوکاریوتی را فراهم می‌کنند.

توالی یابی ITS

توالی یابی ITS (Internal Transcribed Spacer) منطقه ITS واقع بین ژن‌های 18S rRNA، 8.5S و 28S rRNA در DNA ریبوزومی قارچ‌ها را هدف قرار می‌دهد.
برای شناسایی و طبقه‌بندی قارچ‌ها استفاده می‌شود.
مناطق ITS به دلیل تغییرپذیری بالای خود نسبت به سایر مناطق ژن‌های rRNA ریبوزومی برای تشخیص گونه‌های نزدیک به هم قارچی بسیار موثر هستند.

مزایای توالی یابی امپلیكون

توالی یابی امپلیكون امکان شناسایی و غربالگری کارآمد واریانت‌های ژنتیکی را فراهم می‌کند.
توالی یابی امپلیكون می‌تواند چندپلکسی کردن (multiplexing) چندین امپلیكون در هر واکنش را پشتیبانی کند که پوشش بالای مناطق هدف را تضمین می‌کند.
این روش در مقایسه با روش‌هایی مانند توالی یابی کل ژنوم هزینه‌ها و زمان چرخش را کاهش می‌دهد زیرا به خوانش‌های کمتری در هر نمونه و معرف‌های کمتری نیاز دارد.
توالی یابی امپلیكون به ورودی DNA کم نیاز دارد.
کار جریان مبتنی بر PCR توالی یابی امپلیكون در مقایسه با روش‌های هیبریداسیون کاپچر سریع‌تر و ساده‌تر است.

محدودیت‌های توالی یابی امپلیكون

توالی یابی امپلیكون از تکثیر PCR استفاده می‌کند که می‌تواند سوگیری از جمله تکثیر ناهموار را معرفی کند که بر دقت توالی یابی تأثیر می‌گذارد.
طراحی ضعیف پرایمر می‌تواند منجر به کاهش ویژگی و تکثیر خارج از هدف شود.
این روش توالی یابی فقط بر روی مناطق خاص تمرکز دارد و ممکن است تغییرات ژنتیکی مهم خارج از مناطق هدف را از دست بدهد.
مواد اولیه تخریب شده یا آلوده می‌توانند منجر به تکثیر ضعیف و نتایج کاذب شوند.

کاربردهای توالی یابی امپلیكون

توالی یابی امپلیكون برای تشخیص جهش‌های مرتبط با صفات مختلف و بیماری‌های ارثی استفاده می‌شود. می‌توان از آن برای شناسایی جهش‌های ژنتیکی نادر در نمونه‌های پیچیده و تشخیص جهش‌های با فرکانس پایین که توسط سایر تکنیک‌ها از دست رفته‌اند استفاده کرد.
توالی یابی امپلیكون برای شناسایی و مشخص‌سازی پاتوژن‌ها در نمونه‌های بالینی استفاده می‌شود.
در نظارت بر پاتوژن‌ها در فاضلاب و ردیابی واریانت‌های ویروسی استفاده شده است. توالی یابی امپلیكون همچنین می‌تواند در کشاورزی برای شناسایی تغییرات ژنتیکی در محصولات زراعی و تشخیص پاتوژن‌های گیاهی برای مدیریت بیماری‌های گیاهی استفاده شود.
توالی یابی امپلیكون در فیلوژنی برای طبقه‌بندی و شناسایی گونه‌های جدید با مقایسه توالی‌های امپلیكون با پایگاه‌های داده شناخته شده استفاده می‌شود. همچنین برای مطالعه تنوع ژنتیکی و روابط تکاملی بین گونه‌های مختلف مفید است.
توالی یابی امپلیكون برای شناسایی و طبقه‌بندی میکروارگانیسم‌ها در محیط‌های مختلف استفاده می‌شود.
توالی یابی امپلیكون را می‌توان برای پروفایلینگ (profiling) DNA در تحقیقات پزشکی قانونی استفاده کرد.

همچنین بخوانید:

مترجم: محمد صادق محمودی لرد

منبع

از این مطلب چقدر راضی بودید؟

روی ستاره کلیک کنید تا نظرتون ثبت بشه