مقدمه‌ای بر آماده سازی نمونه برای فلوسایتومتری
آماده‌سازی نمونه‌ها برای خواندن توسط فلوسایتومتری یک مرحله مهم است که می‌تواند به طور قابل‌توجهی بر دقت و قابلیت اطمینان نتایج تأثیر بگذارد. این فرآیند شامل چندین مرحله کلیدی است تا اطمینان حاصل شود که سلول ها به درستی آماده و تجزیه و تحلیل می شوند. در اینجا چند مراحل عمومی آماده سازی نمونه ها برای خواندن توسط فلوسایتومتری آورده شده است:
1- جمع آوری و آماده سازی سلول ها به صورت تک تک: اولین مرحله در آماده سازی نمونه ها برای فلوسایتومتری، جمع آوری سلول های مورد نظر و پردازش آنها بر اساس آن است. این مرحله ممکن است شامل جداسازی سلول‌ها از بافت‌ها یا نمونه‌های خون با استفاده از تکنیک‌هایی مانند سانتریفیوژ با گرادیان چگالی یا جداسازی به واسطه بیدهای مغناطیسی باشد.
2- تثبیت و نفوذپذیری سلولی: هنگامی که سلول ها جمع آوری شدند، جهت رنگ آمیزی مارکرهای داخل سلولی ممکن است نیاز به تثبیت و نفوذپذیری داشته باشند تا ساختار آنها حفظ شود و امکان تشخیص پروتئین های داخل سلولی فراهم شود. تثبیت را می توان با استفاده از پارافورمالدئید یا اتانول به دست آورد، در حالی که نفوذپذیری ممکن است شامل استفاده از مواد شوینده مانند Triton X-100 باشد.
3- مسدود کردن اتصال های غیر اختصاصی و ناخواسته: برای جلوگیری از اتصال غیراختصاصی آنتی‌بادی‌ها و دیگر معرف‌ها به سلول‌ها، ضروری است که هر مکان غیرمجاز روی سطح سلول مسدود شود. این کار را می توان با انکوبه کردن سلول ها با محلول مسدود کننده حاوی پروتئین هایی مانند آلبومین سرم گاوی (BSA) یا سرم انسان و حیوان انجام داد.
4- رنگ آمیزی با آنتی بادی های فلورسنت: یکی از مهم ترین مراحل در آماده سازی نمونه فلوسایتومتری، رنگ آمیزی سلول ها با آنتی بادی های نشاندار شده با فلورسنت خاص برای پروتئین های مورد نظر است. این آنتی بادی ها به آنتی ژن های هدف خود در سطح سلول یا درون سلول متصل می شوند و امکان تشخیص آنها توسط فلوسایتومتر را فراهم می کنند.
در طول مرحله انکوباسیون با یک آنتی بادی کونژوگه برای آنالیز فلوسایتومتری، هدف اولیه فعال کردن اتصال اختصاصی آنتی بادی به آنتی ژن هدف خود در سطح سلول است. این مرحله حیاتی نقشی اساسی در تشخیص دقیق و تعیین کمیت جمعیت‌های سلولی خاص در یک نمونه سلولی ناهمگن دارد.
فرآیند انکوباسیون معمولاً شامل اختلاط نمونه حاوی سلول های مورد نظر با آنتی بادی کنژوگه است و زمان کافی برای اتصال آنتی بادی به آنتی ژن هدف خود را می دهد. اختصاصی بودن این برهمکنش برای متمایز ساختن سلول‌هایی که آنتی‌ژن را بیان می‌کنند از سلول‌هایی که بیان نمی‌کنند ضروری است.
بهینه سازی مناسب زمان و دمای انکوباسیون برای اطمینان از حداکثر کارایی اتصال و به حداقل رساندن سیگنال های پس زمینه غیر اختصاصی بسیار مهم است. علاوه بر این، استفاده از معرف‌های مسدودکننده و مراحل شستشو می‌تواند به کاهش اتصال غیراختصاصی کمک کند و ویژگی و حساسیت سنجش را افزایش دهد.
5- شستشو و تعلیق مجدد: پس از رنگ آمیزی، سلول ها باید شسته شوند تا هر گونه آنتی بادی یا باقی مانده که می تواند در تجزیه و تحلیل اختلال ایجاد کند، حذف شود. این کار را می توان با سانتریفیوژ کردن و معلق کردن مجدد سلول ها در محلول بافری مانند سالین بافر فسفات (PBS) برای حفظ زنده ماندن و پایداری سلول انجام داد.
6- کنترل کیفیت و اعتبارسنجی: قبل از خوانش نمونه ها با فلوسایتومتری، انجام بررسی های کنترل کیفیت برای اطمینان از موفقیت آمیز بودن فرآیندهای رنگ آمیزی و آماده سازی نمونه بسیار مهم است. این کار ممکن است شامل استفاده از نمونه‌ها یا بیدهای کنترل برای تأیید عملکرد دستگاه و تأیید پروتکل رنگ‌آمیزی باشد.
7- در نهایت، آماده‌سازی نمونه برای فلوسایتومتری ممکن است شامل مرتب‌سازی سلولی برای جداسازی جمعیت‌های سلولی خاص باشد.
جداسازی سلولی را می‌توان با استفاده از فلوسیتومترهای مجهز به قابلیت sorting به دست آورد و به محققان این امکان را می‌دهد تا سلول‌ها را بر اساس ویژگی‌ها یا بیان نشانگرشان جدا کنند. این امکان تجزیه و تحلیل پایین دستی جمعیت های سلولی خالص شده را برای تحقیقات یا آزمایش های بیشتر فراهم می کند.
با دنبال کردن این مراحل و اطمینان از آماده‌سازی نمونه مناسب، محققان می‌توانند داده‌های دقیق و قابل اعتماد فلوسایتومتری را به دست آورند که می‌تواند بینش‌های ارزشمندی در مورد جمعیت‌های سلولی، سطوح بیان پروتئین و آنالیز نشانگرهای زیستی ارائه دهد. آماده سازی نمونه مناسب کلید دستیابی به نتایج قوی و قابل تکرار در آزمایشات فلوسایتومتری است.
مثالی از آماده سازی جهت بررسی سلول‌های حافظه Tدر پائین آمده است:
سلول‌های تک هسته‌ای خون محیطی (PBMCs) نقش مهمی در پاسخ‌های ایمنی دارند و اغلب در تحقیقات برای شناسایی سلول‌های حافظه T استفاده می‌شوند. آماده سازی PBMC ها برای شناسایی سلول های حافظه T برای خواندن توسط فلوسایتومتری شامل چندین مرحله به ترتیب زیر می شود:
اول از همه، نمونه‌های خون از اهداکنندگان جمع‌آوری شده و برای جداسازی PBMC پردازش می‌شوند. این مرحله معمولاً به واسطه سانتریفیوژ با گرادیان چگالی با استفاده از محلول Ficoll-Paque است که PBMC ها را بر اساس چگالی آنها از سایر اجزای خون جدا می کند. سپس PBMC های جدا شده شسته شده و مجدداً در یک PBS معلق می شوند تا زنده ماندن سلول در طول پردازش بیشتر حفظ شود.
برای شناسایی سلول های حافظه T در جمعیت PBMC، از مارکرها و آنتی بادی های خاص برای آنالیز فلوسایتومتری استفاده می شود. سلول های حافظه T را می توان بر اساس بیان نشانگرهای سطحی مانند CD45RO، CD45RA و CD3 به زیر مجموعه های مختلفی طبقه بندی کرد.
با استفاده از پانلی از آنتی بادی های نشاندار شده با فلورسنت که این نشانگرها را هدف قرار می دهند، محققان می توانند بین جمعیت های مختلف سلول های حافظه T در نمونه PBMC تمایز قائل شوند.
قبل از آنالیز فلوسایتومتری،PBMC ها معمولاً با رنگ زنده رنگ آمیزی می شوند تا سلول های مرده را از تجزیه و تحلیل حذف کنند. این موضوع کمک می کند تا اطمینان حاصل شود که فقط سلول های زنده ارزیابی می شوند، که برای به دست آوردن داده های دقیق بسیار مهم است.
علاوه بر این، ترکیبی از آنتی‌بادی‌های نشاندار شده با فلورسنت که نشانگرهای سلول T و آنتی‌ژن‌های سطح سلول حافظه را هدف قرار می‌دهند برای شناسایی اختصاصی سلول‌های حافظه T در جمعیت PBMC استفاده می‌شود.
پس از اضافه کردن آنتی بادی ها انکوباسیون به طور معمول در درمان یخچال به مدت 30 دقیقه انجام می شود. برای متوقف کردن رنگ آمیزی و شست و شوی رنگ های اضافی، 1 میلی لیتر PBS اضافه شده و سانتریفیوژ در 400g به مدت 3 دقیقه انجام می شود. محلول روی دور ریخته شده و به هر یک از لوله ها بین 300 تا 500 میلی لیتر PBS اضافه می گردد.
هنگامی که نمونه PBMC به طور مناسب رنگ آمیزی شد، برای تجزیه و تحلیل از طریق فلوسیتومتر عبور داده می شود. فلوسایتومتری یک تکنیک قدرتمند است که امکان تجزیه و تحلیل چند پارامتری سلول های جداگانه را بر اساس خواص فلورسنت آنها فراهم می کند.
با تجزیه و تحلیل سیگنال های فلورسانس منتشر شده توسط PBMC های رنگ آمیزی شده، محققان می توانند جمعیت سلول های حافظه T خاص موجود در نمونه را شناسایی و کمیت کنند. سپس داده های تولید شده از آنالیز فلوسایتومتری پردازش و تفسیر می شود تا زیر مجموعه های سلول حافظه T در نمونه PBMC مشخص شود.
همچنین بخوانید:
