تکنیک Nested PCR

واکنش زنجیره ای پلیمراز تودرتو (nested PCR)

واکنش زنجیره ای پلیمراز تو در تو ( Nested PCR)نسخه اصلاح شده واکنش زنجیره ای پلیمراز ساده در نظر گرفته می شود و به منظور کاهش اتصالات غیر اختصاصی در محصولات به کار می رود.

آغازگرها:

واکنش زنجیره ای پلیمراز تو در تو شامل دو مجموعه آغازگر (primer) است که در دو دوره متوالی از واکنش زنجیره ای پلیمراز استفاده می شود به طوری که مجموعه دوم برای تقویت هدف ثانویه در محصول اول استفاده می شود. این اجازه می دهد تا در تعداد دورهای کم محصول دور اول تقویت شده و محصولات غیر اختصاصی را محدود شوند. دومین مجموعه آغازگر فقط باید محصول مورد نظر را از دور اول تقویت کند نه محصول غیر اختصاصی را. این امر به شما امکان می دهد چرخه های بیشتری را اجرا کنید و ضمن به حداقل رساندن محصولات غیر اختصاصی، این PCR برای الگوهای نادر یا PCR با پس زمینه بالا مفید است.

پروتکل:

1. سنتز cDNA

• آماده سازی محلول شامل:

1. μl oligo (dT) 1 (500 μg/ml)
2. 1 ng-5 μg total RNA
3. 1 μl 10 mM dNTPs
4. اضافه کردن RNase-free تا حجم 12 μl

• به مدت 5 دقیقه در دمای 70 درجه سانتیگراد انکوبه کنید تا ساختار ثانویه RNA به حداقل برسد سپس به سرعت روی یخ گذارید و بعد از آن موارد زیر را به ترتیب اضافه کنید:

5. 4 μl 5x Reverse Transcriptase buffer
6. 2 μl 0.1 M DTT
7. 1 μl RNase inhibitor

• به مدت 2 دقیقه در دماي 42 درجه سانتيگراد انکوبه شود.
• 1 μlترانس کریپتاز معکوس را اضافه کنید و برای مدت زمان 50 دقیقه در دمای 40 درجه سانتیگراد انکوبه کنید تا زمان آغازگر شروع به کار کرده و سپس واکنش را در 70 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه خاتمه دهید.

2. اولین واکنشPCR

• آماده سازی محلول شامل:

1. μl 10x PCR buffe5 (با MgCl2)
2. 1 μl 10 mM dNTP
3. 1 μl primer A
4. 1 μl Taq DNA polymerase
5. 2 μl cDNA سپس اضافه کردن 50 μl آب2

• 2 دقیقه در دمای 94 درجه سانتیگراد انکوبه کنید تا cDNA را تغییر دهید.
• 15-40 چرخه PCR را انجام دهیدولی شرایط آن باید از طریق تجربی مشخص شود.

3. دومین واکنشPCR

• آماده سازی محلول شامل:

1. 5 μl 10x PCR buffe (با MgCl2)
2. 1 μl 10 mM dNTP1 μl primer B
3. 1 μl Taq DNA polymerase
4. 1-5 μl از محصول PCR اول و اضافه کردن آب تا حجم 50 μl

• 2دقیقه در دمای 94 درجه سانتیگراد انکوبه کنید تا cDNA را تغییر دهید
• . 15-40 چرخه PCR را انجام دهیدولی شرایط آن باید از طریق تجربی مشخص شود.
• محصولات PCR روی ژل آگارز رنگ آمیزی شده با اتیدیم برماید، تجسم می شوند.

مطالعات بیشتر در بخش راهنمای علمی سایت