تکنیک ها
تکنیک تست لوسیفراز
نحوه عملکرد تکنیک تست Luciferase
سنجش لوسیفراز معمولاً به عنوان ابزاری برای مطالعه بیان ژن در سطح رونویسی استفاده می شود. این ماده به دلیل در دسرس و نسبتاً ارزان بودن بسیار مورد استفاده قرار گرفته و می تواند به صورت کمی نتایج را ارائه دهد. این سنجش کاربردهای گسترده ای در زمینه های مختلف زیست شناسی سلولی و مولکولی دارد یعنی هر کجا که می خواهید بیان یک ژن کلون شده را اندازه گیری یا ردیابی کنید.
واکنش در قلب تکنیک تست لوسیفراز
لوسیفرازها کلاس های آنزیمی اکسیداتیو موجود در چندین گونه را تشکیل می دهند و ارگانیسم های دارای آن می توانند از خود نور های زیستی تابش کنند. معروف ترین این آنزیم ها لوسیفراز کرم شب تاب است. کرم های شب تاب قادر به انتشار نور از طریق یک واکنش شیمیایی هستند که در آن لوسیفرین توسط آنزیم لوسیفراز به اکسیلیسیفرین تبدیل می شود. برخی از انرژی آزاد شده توسط واکنش زیر به صورت نور است:
این واکنش با انرژی، بسیار کارآمد است و این بدان معناست که تقریباً تمام انرژی وارد شده به واکنش به سرعت به نور تبدیل می شود. این مسئله بسیار حساس بوده که برای سنجش بیان بسیار عالی است.
پروتکل تکنیک تست لوسیفراز
- 4 حجم از آب را به 1 حجم بافر 5x لیز اضافه کنید. قبل از استفاده بافر لیز 1x را با دمای اتاق متعادل کنید.
- با دقت محیط کشت را از سلولهایی که مورد سنجش قرار می گیرند جدا کنید.
- سلول ها را با PBS بشویید. (2 بار)
- به اندازه کافی بافر لیز 1x را به سلول ها اضافه کنید تا سطح فلاسک یا پلیت را پوشش دهد.
- برای اطمینان از پوشش کامل سلول ها با بافر لیز، چندین مرتبه ظروف کشت را تکان دهید. سلول ها را از ظرف جدا کنید. سلول ها و همه مایع را به یک لوله میکروسانتریفیج منتقل کنید.
- لوله را روی یخ قرار دهید.
- لوله میکروسانتریفیوژ را 10-15 ثانیه اینورت کنید، سپس سانتریفیوژ را در 12000 × g به مدت 15 ثانیه (در دمای اتاق) یا حداکثر 2 دقیقه (در 4 درجه سانتیگراد) انجام دهید.
- مایع رویی را به یک لوله جدید منتقل کنید.
- 9. 20 میکرولیتر از سلول بدست آمده را به تیوب جدیدی انتقال دهید.
- به تیوب جدید 100 میکرولیتر از مواد کیت لوسیفراز اضافه کنید و خوب مخلوط کنید.
- پس از گذشت 10 ثانیه (بسته به نوع کیت) تیوب را در زمان های مورد نظر در دستگاه لومینومتر بررسی کنید.
برای مطالعه سایر تکنیک آزمایشگاهی کلیک کنید.
برای مشاهده و ثبت نام دوره کارآموزی کشت سلولی اینجا کلیک کنید
برای سفارش خدمات به آزمایشگاه کشت سلول ژنیران اینجا کلیک کنید
