CRISPR-cas9 چیست؟

CRISPR-cas9 چیست؟

فناوری CRISPR ابزاری ساده اما قدرتمند برای ویرایش ژنوم است . این ابزار اجازه می دهد تا محققان به راحتی توالی DNA و عملکرد ژن را تغییر دهند . بسیاری از کاربردهای بالقوه آن شامل تصحیح نقایص ژنتیکی ، معالجه و جلوگیری از شیوع بیماریها و بهبود محصولات زراعی است . با این حال ، وسعت آن نگرانی های اخلاقی را نیز برانگیخته است.

در کاربردهای رایج ، “CRISPR”  عنوان کوتاه برای  “CRISPR-Cas9” است.  CRISPR ها بخشهای خاصی از DNA هستند.  پروتئین Cas9 آنزیمی است که مانند یک جفت قیچی مولکولی عمل می کند و قادر به برش رشته های DNA است.

 CRISPR (به طور منظم در تکرارهای پالیندرومی کوتاه در فاصله بین گروهها قرار دارد) خانواده ای از توالی های DNA است که در ژنوم ارگانیسم های پروکاریوتی مانند باکتری ها و آرکی ها وجود دارد.  این توالی ها از قطعات DNA باکتریوفاژهایی که قبلاً پروکاریوت را آلوده کرده بودند گرفته شده است . آنها برای تشخیص و از بین بردن DNA از باکتریوفاژهای مشابه در طی عفونت های بعدی استفاده می شوند . از این رو این توالی ها نقش اساسی در سیستم دفاع ضد ویروسی (یعنی ضد فاژ) پروکاریوت ها دارند.

 Cas9 آنزیمی است که از توالی CRISPR به عنوان راهنمایی برای تشخیص و شکاف رشته های خاص DNA که مکمل توالی CRISPR هستند استفاده می کند.  آنزیم های Cas9 به همراه توالی CRISPR اساس فناوری شناخته شده به نام CRISPR-Cas9 را تشکیل می دهند که می تواند برای ویرایش ژن ها در موجودات زنده باشد.  این فرایند ویرایش دارای کاربردهای متنوعی از جمله تحقیقات اساسی بیولوژیکی ، توسعه محصولات بیوتکنولوژی و درمان بیماریها است.

سیستم CRISPR-Cas یک سیستم ایمنی پروکاریوتی است که مقاومت در برابر عناصر ژنتیکی خارجی مانند موارد موجود در پلاسمیدها و فاژها را فراهم می کند و نوعی مصونیت به دست آمده را فراهم می کند. CRISPR در تقریبا 50٪ ژنوم باکتری توالی و تقریبا 90٪ از آرکی ها توالی مشاهده می شود.

Cas9 و هسته های RNA هدایت شده برای ویرایش ژنوم

CRISPR-Cas یک سیستم ایمنی سازگار با میکروبی است که از هسته های هدایت شده با RNA برای برش عناصر ژنتیکی خارجی 18،19،20،21،26 استفاده می کند. سه نوع (I-III) سیستم های CRISPR در طیف گسترده ای از میزبان های باکتریایی و آرکی ها شناسایی شده اند ، در حالی که هر سیستم شامل خوشه ای از ژن های مرتبط با CRISPR (Cas) ، RNA های غیر کد کننده و یک آرایه متمایز از عناصر تکراری (تکرار مستقیم) است. این تکرارها توسط توالیهای متغیر کوتاه 20 مشتق شده از اهداف DNA برون زا که به عنوان پیش بینی کننده شناخته می شوند ، بین هم قرار گرفته اند و در کنار هم آنها آرایه CRISPR RNA (CRRNA) را تشکیل می دهند.

کاربرد ها

• ویرایش ژن CRISPR

از فناوری CRISPR در صنایع غذایی و کشاورزی برای مهندسی فرهنگ پروبیوتیک و ایمن سازی فرهنگهای صنعتی (برای مثال ماست) در مقابل عفونتها استفاده شده است.  همچنین از این گیاهان برای تقویت عملکرد ، تحمل به خشکی و خانه های تغذیه ای استفاده می شود.

در اواخر سال 2014 ، حدود 1000 مقاله تحقیقاتی منتشر شد که از CRISPR نام برد.  از این فناوری برای غیرفعال کردن عملکرد ژنها در رده های سلولی و سلول های انسانی ، برای مطالعه کاندیدا آلبیکنس ، اصلاح مخمرها استفاده شده برای ساختن سوخت های زیستی و اصلاح ژنتیکی سویه های زراعی استفاده شده است.CRISPR  همچنین می تواند برای تغییر پشه ها استفاده شود بنابراین آنها نمی توانند بیماری هایی مانند مالاریا را منتقل کنند . رویکردهای مبتنی بر CRISPR با استفاده از Cas12a اخیراً در اصلاح موفقیت آمیز تعداد زیادی از گونه های گیاهی مورد استفاده قرار گرفته است.

در ژوئیه سال 2019 ، از CRISPR برای یک بیمار مبتلا به اختلال ژنتیکی استفاده شد.  بیمار زنی 34 ساله با بیماری سلول داسی بود.

در مارس 2020 ، ویروس اصلاح شده با CRISPR در تلاش برای درمان Leber congenital amaurosis به چشم بیمار تزریق شد.

در آینده ، ویرایش ژن CRISPR به طور بالقوه می تواند مورد استفاده قرار گیرد برای ایجاد گونه های جدید یا احیای گونه های منقرض شده از گونه های نزدیک به آنها.

ارزیابی مجدد مبتنی بر CRISPR در مورد ادعاهای مربوط به روابط ژن با بیماری منجر به کشف ناهنجاری های بالقوه مهم شده است.

•  CRISPR به عنوان ابزار تشخیصی

نوکلئازهای مرتبط با CRISPR به دلیل توانایی آنها در هدف قرار دادن توالی های اسید نوکلئیک خاص در پس زمینه بالای توالی های غیر هدف ، به عنوان ابزاری برای آزمایش مولکولی مفید هستند . در سال 2016 ، از هسته Cas9 برای کاهش توالی های ناخواسته نوکلئوتید در کتابخانه های توالی نسل بعدی استفاده شد در حالی که تنها 250 گرم از ورودی اولیه RNA نیاز دارد.  از ابتدای سال 2017 ، هسته های مرتبط با CRISPR همچنین برای آزمایش مستقیم تشخیصی ، از حساسیت به مولکول منفرد استفاده می شد.

مقایسه CRISPR با سایر فناوریهای ویرایش ژنوم

مانند سایر فن آوری های ویرایشی مانند ZFN و TALENs ، Cas9  می تواند DSB های DNA هدفمند را در مکانهای خاص مورد علاقه ژنوم پستانداران تسهیل کند و ویرایش ژنوم را از طریق NHEJ یا HDR تحریک کند.Cas9  چندین مزیت بالقوه نسبت به ZFN و TALEN ها از جمله سهولت شخصی سازی ، راندمان هدفمندی بالاتر و امکان تسهیل ویرایش ژنوم چندگانه را دارد. مقایسه Cas9 با TALEN :

• سهولت شخصی سازی Cas9 را می توان با خرید یک جفت الیگوس کدگذاری دنباله راهنمای 20 نانومتری ، به راحتی به توالی های جدید DNA انتقال داد. در مقابل ، بازپرداخت TALEN برای یک توالی DNA جدید نیاز به ساخت دو ژن جدید TALEN دارد.  اگرچه پروتکل های متنوعی برای ساخت TALEN14،17،48،49 وجود دارد ، اما ساخت یک جفت جدید از TALEN به زمان قابل توجهی نیاز دارد.
• الگوی شکاف  S. pyogenes Cas9 (SpCas9) برای ایجاد یک برش صاف بین پایه های 17 و 18 در دنباله هدف 27 شناخته شده است. جهش پسماندهای کاتالیزوری در RuvC یا حوزه هسته HNH از SpCas9  آنزیم را به آنزیم DNA nicking تبدیل می کند ، در مقابل ، TALEN ها به طور غیرمعمول در پیوند 12-24-جفت باز بین جفت سایتهای اتصال دهنده مونومر TALEN50 جدا می شوند.
• راندمان ویرایش. SpCas9 و TALENs نشان داده كه ویرایش ژنوم را در انواع مختلف سلولها و ارگانیسم ها قابل انجام است. با این حال ، با توجه به سهولت در هدف قرار دادن ، Cas9  می تواند برای هدف قرار دادن چندین مکان ژنومی به طور همزمان ، با ارائه یک ترکیب ترکیبی از sgRNA ها به سلول های مورد علاقه ، استفاده شود.

دوره کارآموزی مهندسی ژنتیک و کلونینگ

آزمایشگاه مهندسی ژنتیک و کلونینگ ژنیران

خدمات مهندسی ژنتیک و کلونینگ