EMB آگار: فرمول، اصول، آماده سازی، نتایج و موارد استفاده

درباره EMB آگار

ائوزین متیلن بلو آگار (Eosin Methylene Blue (EMB) agar) یک محیط میکروبیولوژیکی متمایز است که رشد باکتری‌های گرم مثبت را اندکی مهار می‌کند و نشانگر رنگی است که بین ارگانیسم‌هایی که لاکتوز را تخمیر می‌کنند (مانند E. coli) و ارگانیسم‌هایی که انجام نمی‌دهند (مانند سالمونلا) تمایز می‌دهد. ، شیگلا).
EMB آگار در ابتدا توسط Holt-Harris و Teague ابداع شد و توسط Levine اصلاح شد.
بنابراین ترکیبی از فرمول‌های Levine و Holt-Harris و Teague است که حاوی یک هضم پپتیک از بافت حیوانی و فسفات توصیه شده توسط Levine و دو کربوهیدرات مطابق پیشنهاد Holt-Harris و Teague است.
این محیط در آزمایشگاه‌های پزشکی برای تشخیص میکروب‌های بیماری‌زا گرم منفی در مدت زمان کوتاه اهمیت دارد.

قاعده کلی EMB آگار

• EMB آگار با ترکیبی از دو رنگ ائوزین و متیلن بلو در نسبت 6:1 مشخص می‌شود.
• باکتری‌های گرم منفی که لاکتوز را تخمیر می‌کنند اسید تولید می‌کنند که pH را کاهش می‌دهد. این امر جذب رنگ توسط کلنی‌ها را تشویق می‌کند و با اثر اسید روی رنگ‌ها، کلنی‌ها را بنفش تیره می‌کند.
• علاوه بر این، برخی از باکتری‌های تخمیر لاکتوز، کلنی‌های مسطح و تیره با درخشش فلزی سبز تولید می‌کنند.
• سایر تخمیرکننده‌های لاکتوز کلنی‌های بزرگتر و مخاطی تولید می‌کنند که اغلب فقط مرکز آنها بنفش رنگ است.
• در EMB آگار، بیشتر سویه‌ کلنی‌های coli سبز رنگ مشخص هستند. تخمیر سریع لاکتوز و تولید اسیدهای قوی، بنابراین کاهش سریع EMB Agar ph. عامل حیاتی در تشکیل جلای فلزی سبز مشاهده شده با E.coli، تخمیر سریع لاکتوز و تشکیل اسیدهای قوی است.
• از سوی دیگر، لاکتوز غیر تخمیری ممکن است با دآمیناسیون (deamination) ph پروتئین‌ها را افزایش دهد. این تضمین می‌کند که رنگ جذب نمی‌شود و کلنی‌ها بی رنگ خواهند بود.
• بنابراین تخمیر نشده لاکتوز یا بی رنگ یا به رنگ اسطوخودوس روشن هستند.
• هضم پپتیک (Peptic ) بافت حیوانی به عنوان منبع کربن، نیتروژن و سایر مواد مغذی برای رشد ضروری است.
• لاکتوز و ساکارز منابع انرژی هستند زیرا کربوهیدرات‌های قابل تخمیر هستند.
• ائوزین-Y و متیلن بلو (methylene blue) به عنوان شاخص‌های افتراقی عمل می‌کنند. فسفات محیط را بافر می‌کند.

تهیه و روش استفاده از EMB آگار

1. 96 گرم را در 1000 میلی لیتر آب مقطر معلق کنید.
2. مخلوط کنید تا سوسپانسیون (suspension ) یکنواخت شود. حرارت دهید تا به جوش آید و کاملا حل شود.
3. با اتوکلاو (autoclaving ) با فشار 15 پوند (121 درجه سانتیگراد) به مدت 15 دقیقه استریل کنید. از گرمای بیش از حد خودداری کنید.
4. تا دمای 50-45 درجه سانتیگراد خنک کنید و محیط را تکان دهید تا متیلن بلو (methylene blue) اکسید شود (یعنی رنگ آبی آن بازگردد) و رسوب فلوکولنت (flocculent ) به حالت تعلیق درآید.
5. داخل صفحات پتری (Petri ) استریل بریزید.
6. اجازه دهید صفحات تا دمای اتاق گرم شوند.
7. سطح Agar باید قبل از تلقیح خشک شود.
8. نمونه را در اسرع وقت پس از جمع آوری تلقیح و رگه بزنید.
9. اگر نمونه‌ای که قرار است کشت شود روی سواب (swab) است، سواب را روی ناحیه کوچکی از سطح Agar بغلتانید و برای جداسازی با یک حلقه استریل رگه بزنید.
10. پلیت‌ها را به صورت هوازی در دمای 35-37 درجه سانتیگراد به مدت 18-24 ساعت انکوبه کنید و از نور محافظت کنید.
11. صفحات را برای مورفولوژی (morphology) بررسی کنید. اگر بعد از 24 ساعت منفی بود، 24 ساعت دیگر دوباره انکوبه کنید.

موارد استفاده از EMB آگار

• EMB Agar (Eosin Methylene Blue Agar) برای جداسازی و تمایز باکتری‌های روده‌ای گرم منفی از نمونه‌های بالینی و غیر بالینی توصیه می‌شود.
• در افتراق باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی مفید است.
• به جداسازی و تمایز باسیل‌های روده و باسیل‌های گرم منفی کمک می‌کند.
• از آن برای آزمایش کیفیت آب استفاده می‌شود، به ویژه برای تعیین اینکه آیا آب توسط میکروارگانیسم‌های مضر آلوده شده است.
• این میکروارگانیسم‌ها را در گروه کولون-تیفوئید-اسهال خونی متمایز می‌کند.
• EMB به تمایز بصری اشریشیا کلی، سایر میله‌های گرم منفی روده‌ای تخمیر کننده لاکتوز غیر بیماری‌زا و جنس سالمونلا (Salmonella) و شیگلا (Shigella) کمک می‌کند.
• همچنین به جداسازی و تمایز باسیل‌های روده‌ای تخمیر کننده لاکتوز و باسیل‌های روده‌ای غیر لاکتوزی کمک می‌کند.

محدودیت‌های EMB آگار

• یک محیط تصادفی باید همراه با EMB آگار تلقیح شود.
• توصیه می‌شود برای شناسایی کامل آزمایشات بیوشیمیایی (biochemical)، ایمونولوژیکی (immunological)، مولکولی (molecular) یا طیف سنجی جرمی روی کلنی‌های حاصل از کشت خالص انجام شود.
• برخی از سویه‌های سالمونلا (Salmonella) و شیگلا (Shigella) ممکن است در EMB آگار رشد نکنند.
• برخی از باکتری‌های گرم مثبت مانند انتروکوک‌ها (enterococci)، استافیلوکوک‌ها (staphylococci) و مخمرها روی این محیط رشد می‌کنند و معمولاً کلونی‌های دقیقی را تشکیل می‌دهند.
• موجودات غیر بیماری‌زا و غیر تخمیری لاکتوز نیز در این محیط رشد خواهند کرد. برای تشخیص این موجودات از سویه‌های بیماری‌زا، باید آزمایش‌های بیوشیمیایی بیشتری انجام شود.
• ممکن است برای اطمینان از جداسازی کافی نمونه‌های فلور مخلوط مورد نیاز باشد.
• برخی از سویه‌های coli ممکن است نتوانند یک درخشش فلزی سبز مشخص ایجاد کنند. در نتیجه، جلای فلزی سبز برای E.coli تشخیصی نیست.

با انواع محلول‌ها و مواد آزمایشگاهی بیشتر آشنا شوید

منبع

مترجم: بهار کنعانی