Immunoblotting

برای بررسی پروتیین مورد نظر پس از انجام الکتروفورز ‍‍پروتیین ها به غشایی که قابلیت اتصال و تثبیت دارد، منتقل می شوند.  این انتقال می تواند توسط جریان برق و یا پمپ خلا صورت بگیرد. از جمله این غشا ها می توان به نیتروسلولز و پلی وینیلیدن دی فلورید (PVDF) اشاره کرد. جهت حرکت پروتیین ها از ژل(قطب منفی) به غشاء(قطب مثبت)  در شکل مشخص شده است.

به دلیل ظرفیت بالای غشاء در ‍پذیرش پروتیین ها ، بعد از انتقال باید غشاء را با محلول بلاکینک مسدود کنیم تا از اتصال غیر اختصاصی آنتی بادی به قسمت های خالی غشاء جلوگیری کنیم و آنتی بادی فقط امکان اتصال به پروتیین مورد نظررا داشته باشد. برای این کار ازآلبومین گاوی   (BSA)و یا شیر خشک بدون چربی استفاده می شود. بعد از بلاک کردن آنتی بادی اولیه را با غلظت مناسب اضافه می کنیم. بعد از انکوباسیون و شستشو با TBST آنتی بادی ثانویه را اضافه می کنیم که این آنتی بادی ضد بخش ثابت آنتی بادی اول است و با آنزیم (پراکسیداز) کونژوگه شده است.

بعد از انکوباسیون و شستشو با TBST سوبسترای آنزیم را اضافه می کنیم. یکی از سوبستراهایی که به طور رایج استفاده می شود دی آمینوبنزیدین (DAB)نام دارد. که تولید رسوب قهوه ای رنگ می کند. این باند قهوه ای رنگ به وضوح روی غشاء قابل مشاهده است. سوبسترای دیگری که در وسترن استفاده می شود ECL نام دارد که از مواد کمی لومینسانس می باشد و تولید نور میکند. نور ساطع شده از ECL می تواند یک فیلم رادیولوژی را در اتاق تاریک  بسوزاند و باند های پروتیینی به صورت خطوط تیره روی فیلم دیده می شوند.