در روش های PCR مرسوم تنها از یک جفت توالی پرایمر مختص یک قطعه از DNA استفاده می شود. در این میان جای سوال است که آیا می توان از چند جفت پرایمر مختلف به منظور تکثیر چند بخش مختلف به طور هم زمان در یک تیوب واکنش استفاده کرد؟!!!
پاسخ مثبت است….
Multiplex-PCR تکثیر همزمان بیش از یک توالی هدف در یک لوله واکنش را با استفاده از بیش از یک جفت پرایمر فراهم می کند. در نهایت تشکیل چند محصول متفاوت با سایز های مختلف از هم به وسیله الکتروفورز امکان پذیر خواهد بود. با استفاده از این روش در PCR عملی، می توان تا حد زیادی در زمان و هزینه صرفه جویی کرد.
از زمان معرفی، Multiplex PCR با موفقیت در بسیاری از زمینه‌های تشخیص اسید نوکلئیک، از جمله تجزیه و تحلیل حذف ژن ، تجزیه و تحلیل جهش و پلی‌مورفیسم ، تجزیه و تحلیل کمی (quantitative analysis) و تشخیص RNA استفاده شده است. در زمینه بیماری های عفونی، این تکنیک روشی ارزشمند برای شناسایی ویروس ها، باکتری ها، قارچ ها و یا انگل ها نشان داده شده است.
علاوه بر آن یکی از مزایای دیگر Multiplex PCR تشخیص همزمان چندین ویروس در فرد بیمار که مشکوک به ابتلا به ویروس های متنوعی است، می باشد. این رویکرد می تواند به طور متفاوت ویروس های مختلف را به طور همزمان تشخیص دهد و یک روش موثر برای شناسایی سریع عفونت ویروسی مختلط در تشخیص بالینی است.
نکات مهم در طراحی پرایمر به روش Multiplex-PCR
تکثیر هم زمان دو یا چند هدف در یک واکنش منفرد، تا حد زیادی به سازگاری پرایمرهای PCR مورد استفاده در واکنش بستگی دارد.
یکی از عوامل مهم سازگاری دمای ذوب پرامیرها می باشد به این معنی که همه ی پرایمرها در واکنش باید دمای ذوب (Tm) مشابه داشته باشند، بنابراین هر جفت پرایمر به توالی‌های DNA مکمل خود در دماهای تقریباً یکسان متصل شده بنابراین با انتخاب تنها یک دما اجازه پیشرفت واکنش به خوبی برای همه پرایمرها وجود خواهد داشت.
اگر یک جفت پرایمر در زمانی که جفت پرایمر دیگری از هدف خود جدا می شود، در حال متصل شدن به الگو باشد، این روش انجام نشده و با مشکل مواجه خواهد شد. بنابراین، همه پرایمرها باید طوری انتخاب شوند که Tm آنها اختلاف بسیار اندکی باهم داشه باشند.
مورد دوم که می بایست در طراحی پرایمر ها حائز اهمیت واقع شود ،طراحی به گونه ای است که هیچ یک از جفت پرایمرها نباید با یکدیگر مکمل باشند تا تشکیل دایمر پرایمر در واکنش به حداقل برسد. با این کار هر تکثیر مستقل از بقیه انجام شده (تا زمانی که هیچ یک از مواد در غلظت های محدود کننده سرعت وجود نداشته باشند) و هر محصول یا آمپلیکون اختصاصی بدون محدودیت به سنتز ادامه می دهد.
مورد سوم در انتخاب پرایمرها ،انتخاب پرایمرهای با سایز محصولات کوچک و تقریبا نزدیک به هم (100 تا 500 جفت باز) می باشد بنابراین هر کدام با کارایی بالا و با سرعت مساوی سنتز می شوند. البته که باید توجه کنیم که هرگز محصولات با اندازه ی کاملا یکسان را در Multiplex PCR توسط پرایمرهای گوناگون تکثیر نکنیم، زیرا قابل تفکیک در الکتروفورز نخواهند بود.
هر روش Multiplex-PCR باید یک مرحله تشخیص نیز داشته باشد که ارزیابی کند که همه ی محصولات اختصاصی تکثیر شده اند و بتواند هر آمپلیکون را شناسایی کند. این امر با الکتروفورز امکان پذیر است. در صورتی که اندازه ی محصولات تکثیر یافته اختلاف کمی باهم داشته باشند (کمتر از 30 جفت باز حدودا) برای تفکیک بهتر قطعات تکثیر شده بهتر است از الکتروفورز عمودی (ژل آکریل آمید) استفاده نمود، زیرا قدرت تفکیک خیلی بالاتری نسبت به الکتروفورز افقی (ژل آگارز) دارد.
مزایا و معایب روش Multiplex-PCR
مزیت Multiplex PCR این است که می توان در مصرف پلیمراز و DNA الگو صرفه جویی کرد. در روش Multiplex PCR همچنین می توان از مجموعه ای از پرایمرها به عنوان کنترل داخلی استفاده کرد تا بتوانیم احتمال مثبت یا منفی کاذب را از بین ببریم. مشکلات بالقوه در PCR شامل منفی کاذب به دلیل شکست واکنش یا مثبت کاذب به دلیل آلودگی است.
منفی های کاذب اغلب در تکثیر چندگانه (multiplex amplification) آشکار می شوند زیرا هر آمپلیکون یک کنترل داخلی برای سایر قطعات تکثیر شده فراهم می کند. به عنوان مثال، در Multiplex PCR هایی که حذف ژنی را بررسی می کنند، می توان چندین اگزون را تکثیر کرد، در این صورت اگر چند قطعه هم حذف شده باشند، تکثیر قطعه یا قطعات دیگر نشان دهنده درست کار کردن و عدم شکست PCR است.
با افزودن یک آمپلیکون کنترل خارجی علاوه بر توالی های هدف، شکست کامل PCR را می توان از یک نتیجه ی معنادار عدم تکثیر قطعات، متمایز کرد. علاوه بر نظارت بر شکست PCR، می توان آمپلیکون های کنترل داخلی را برای تأیید وجود الگوی هدف (مثلا پاتوژن آلوده کننده) طراحی کرد.
اگرچه استفاده از Multiplex PCR می‌تواند هزینه‌ها و زمان را برای شناسایی همزمان دو، سه یا چند عامل بیماری‌زا در یک نمونه کاهش دهد، Set up کردن PCR پیچیده‌تر است (منظور رسیدن به بهینه ترین شرایط آزمایش می باشد) و اغلب حساسیت کمتری نسبت به PCR تک پرایمری دارد.
Digital PCR
واکنش زنجیره ای پلیمراز PCR توسط سه نسل ارتقا یافته است. اولین نسل PCR برای تجزیه و تحلیل محصولات PCR به الکتروفورز ژل متکی است، که همیشه با محدودیت تشخیص کم، کار پر زحمت و تنها رسیدن به نتیجه کیفی به چالش کشیده می شود. نسل دوم PCR که PCR کمی زمان واقعیRT-qPCR نیز نامیده می‌شود، می‌تواند با استفاده از منحنی‌های استاندارد محصولات را کمی کند، اما نسبت به مواد مزاحم همچون دایمر پرایمرها و آلودگی ها حساس می باشد.
دیجیتال PCR (dPCR) سومین نسل از PCR است که کمیت مطلق را از طریق پارتیشن بندی واکنش امکان پذیر می کند. این فناوری که در تشخیص مولکولی بسیار حساس و دقیق است، کاربردهایی مانند تشخیص ردیابی DNA، تشخیص جهش نادر و تنوع تعداد کپی را نشان داده است.
در dPCR، واکنش PCR به محفظه هایی با حجم کوچک متعدد (درحد نانومتر) تقسیم می شود، که در آن مولکول های RNA و DNA هدف تقسیم به طور تصادفی توزیع می شوند. هر بخش دارای صفر، یک یا چند مولکول است. پس از تکثیر، جذب نوری در هر بخش اندازه گیری می شود. محفظه ای که مولکول هدف نداشته باشد 0 و محفظه ای که دارای یک مولکول هدف باشد 1 محاسبه می شود.
تعداد نسخه اولیه و چگالی DNA هدف با آمار پواسون و تعداد واکنش های PCR مثبت محاسبه می شود. از نظر تئوری، هنگامی که مخلوط سنجش دارای چگالی کمی از DNA هدف است و ریزواکنش ها به اندازه کافی بزرگ هستند، فقط 0 یا 1 باید شمارش شود. در این شرایط، تعداد محفظه هایی که فلورسانس روشن را نشان می دهند برابر با مولکول های DNA هدف است. با این حال، یک محفظه اغلب حاوی بیش از یک مولکول هدف است که تعداد آنها باید با آمار پواسون اصلاح شود.
Droplet Digital PCR (ddPCR) یک روش dPCR است که در آن یک واکنش نمونه 20 میکرولیتری شامل پرایمرهای سنجش و پروب‌های Taqman یا یک رنگ Intercalating ،به 20000 قطره روغن به اندازه نانولیتر از طریق روش امولسیون آب-روغن تقسیم می‌شود. در این روش قدرتمند به دلیل جداسازی کامل واکنش ها از هم در قطرات روغن مجزا ،رقابت منفی پرایمرها با هم از بین می رود و امکان تکثیر قطعات بسیار بیشتری به صورت هم زمان در یک واکنش نسبت به روش Multiplex PCR فراهم می شود.
در دوره کارآموزی ژنتیک مولکولی تکنیک Multiplex PCR را بصورت عملی یاد بگیرید
References
https://www.sciencedirect.com/topics/immunology-and-microbiology/multiplex-polymerase-chain-reaction.
Elnifro EM, Ashshi AM, Cooper RJ, Klapper PE. Multiplex PCR: optimization and application in diagnostic virology. Clin Microbiol Rev. 2000
https://genome.cshlp.org/content/3/4/S65.full.pdf+html Oct;13(4):559-70. doi: 10.1128/CMR.13.4.559. PMID: 11023957; PMCID: PMC88949.
