PCR چیست؟

 

 PCR چیست؟ از PCR در زیست شناسی مولکولی برای تهیه نسخه های زیادی از بخش های کوچک دی ان ای یا یک ژن استفاده می شود. در موجودات زنده، مجموعه ای از چند آنزیم در فرآیند همانند سازی DNA نقش دارند. در این تکنیک ابتدا پرايمر از DNA  موردنظر، طراحي مي شود و بعدا با استفاده ازPCR ، هدف را تكثير كرده و توسط الكتروفورز در مقابل يك كنترل مي سنجند.

مواد و وسایل لازم برای PCR:

1. DNA الگو

پی سی آر روشی است كه به واسطه آن مي توان از يك رشته DNA الگو، تعداد زيادي رشته DNA به دست آورد به شرطي كه دو انتهاي رشته  DNAكه قصد تكثيرش را داريم، كاملا شناخته شده باشد.

• دزوکسی نوکلئوتید تری فسفات(dNTP)

چهار نوکلئوتید تشکیل دهنده قطعهDNA ، واحد های ساختمانی هستند که توسط DNA پلیمراز برای ساختن دو رشته های  DNAی جدید بکار می رود و باید كنار هم چيده شوند تا رشته مكمل را ايجاد كنند.

• پرایمر forward و reverse

پرایمرها قطعات کوچک پلی نوکلئوتیدی هستند و در آزمایشگاه به گونه ای طراحی و سنتز شده اند که دارای سکانس نوکلئوتیدی مکمل با ناحیه َ۳ در یکی از رشته های DNAی مورد نظر هستند. چون آنزیم DNA پلیمراز به قطعات پرایمر متصل می شود، در نتیجه فقط مولکول DNAی هدف، همانند سازی و تکثیر می گردد. از آنجائيکه DNA دو رشته ای است، دو نوع پرايمر در PCR مورد نياز است. پرايمرها دو عمل انجام مي دهند؛ اول اين كه محل ژني را كه بايد تكثير شود مشخص مي‌كنند و دوم اين كه اندازه قطعات تكثير شونده را تعيين مي كنند.

• Taq DNA polymerase

DNA پلیمراز آنزیمی است که با استفاده از نوکلئوتیدها، رشته الگو و یک قطعه پرایمر قادر به همانند سازی است.DNA  پليمراز DNA تک رشته ای را از جهت 5َ    3َ به عنوان الگو مورد استفاده قرار می دهد و رشته مکمل را در جهت 3َ   5َ می سازد.

• بافر

بافر شرایط محیطی مناسبی را از نظر pH و یونهای مختلف ایجاد می کند تا پایداری DNA پلیمراز و فعالیت بهینه آن تامین شود. اجزای این بافر نقش های دیگری نیز دارند از جمله کلرید پتاسیم که به اتصال پرایمر به DNA  الگو (نمونه) کمک می کند.

• کاتیون های دو و تک ظرفیتی

یون منیزیم یکی از اساسی ترین اجزا واکنش PCR می باشد. انواع مختلف آنزیم DNA  polymerase برای فعالیت خود به این یون نیاز دارند و این یون (عمدتاً به صورت ترکیب کلرید منیزیم(Mgcl₂) برای اتصال پرایمر و قطعه DNA لازم است. این ترکیب گاهی در همان بافر PCR قرار داده می شود ولی از آنجا که برای برخی واکنش های PCR لازم است که غلظت این یون تغییر نماید، این ترکیب به طور جداگانه تهیه و به واکنش PCR افزوده می شود.

• روغن معدنی (mineral oil)

برای جلوگیری از تبخیر محلول در دستگاه چرخش حرارتي و در نتیجه افزایش غلظت در بخش های بالائی محلول، معمولا یک لایه روغن (معمولا 50 تا 60 ميكروليتر به محلول واكنش 100 ميكروليتري) بر سطح محلول اضافه مي شود. در دستگاه های جدیدتر از درپوش های حرارتی استفاده می شود.

• ترمال سایکلر

دستگاه ترمال سایکلر قابل برنامه ریزی برای ایجاد دماهای مختلف در مدت زمان خاص می باشد.

کاربردهای PCR:

1.  تشخيص بيماري‌هاي قبل از تولد و بیماری هایی از قبیل تالاسمی مینور و ایدز و …
2. عيين جنسيت جنين
3. تشخیص سرطان و بررسی مراحل درمان آن
4. تحقیقات جنایی (forensic analysis)
5. انگشت نگاری ژنتیک (genetic fingerprinting)
6. بررسی DNA قدیمی (ancient DNA)
7. تعیین توالی DNA
8. تعيين توالي های کروموزومی انسان در سلول های هيبريدی هتروکاريوتها
9. کلونینگ با PCR

چند نوع از PCR متداول:

1. Multiplex-PCR: در این تکنیک از چند پرایمر در یک محلول PCR استفاده می شود و با هدف قرار دادن چندین ژن در یک محلول PCR، می توان با آزمایشات کمتر و زمان کوتاهتر، اطلاعات بیشتری جمع آوری کرد.
2. Quantitative PCR: این تکنیک برای بررسی وجود DNA، cDNA یا RNA و همچنین تعیین غلظت آنها بکار می رود. یکی از شاخه های مهم این تکنیک Quantitative real-time PCR است که از نظر صحت (accuracy) در بالاترین سطح قرار دارد و در آزمایشگاه های تشخیص بالینی کاربرد وسیعی یافته است.
3. RT-PCR: این نوع از PCR به منظور شناسایی، استخراج یا تکثیر RNA از نمونه های سلول یا بافت مورد استفاده قرار می گیرد. در این تکنیک از ترانس کریپتاز معکوس (reverse transcriptase) برای تبدیل RNA به cDNA استفاده می شود.
4. Touchdown PCR: یک نوع تغییر یافته از PCR است که موجب کاهش محصول کاذب و پرایمر دایمر می شود. در این روش برنامه PCR به گونه ای طراحی می گردد که در طی سیکل های متوالی، بتدریج دمای مرحله اتصال (Annealing step) کاهش می یابد. بدین ترتیب که در سیکل های ابتدائی، دما در حدود ۳ الی ۵ درجه بالاتر از T_m پرایمر و در سیکل های انتهایی در حدود ۳ تا ۵ درجه پائینتر از T_m پرایمر تنظیم می شود.
5. 5-    ‏ARMS-PCR‏: اين روش تكثيري قدرتمند براي مشخص كردن جهش‌هاي نقطه‌اي است. در اين روش از پرايمرهاي جهش يافته و طبيعي در دو لوله جداگانه استفاده مي‌شود. اگر عمل پليمريزاسيون در لوله حاوي پرايمر طبيعي انجام شود، نشان‌دهنده نبود جهش نقطه‌اي در باز مورد نظر است و اگر عمل پليمريزاسيون در لوله‌ حاوي پرايمر جهش يافته انجام شود، نشان‌دهنده حضور جهش نقطه‌اي در باز مورد نظر است.

لینک های مرتبط:

دوره کارآموزی ژنتیک مولکولی

آزمایشگاه ژنتیک مولکولی

تجهیزات آزمایشگاه ژنیران

آزمایشگاه ژنتیک مولکولی