تکنیک RFLP در PCR چیست؟ اصول و کاربردها

تکنیک RFLP در PCR

تکنیک RFLP در سال 1984 توسط دانشمند انگلیسی الک جفریس (Alec Jeffreys) در جریان تحقیقات مربوط به بیماری‌های ارثی ابداع شد. این روش برای تجزیه و تحلیل الگوهای منحصر به فرد در قطعات DNA به کار می‌رود تا بتوان از طریق این الگوها تمایز ژنتیکی میان موجودات مختلف را بررسی کرد. این الگوها به VNTRs (Variable Number of Tandem Repeats)  شناخته می‌شوند.

پلی‌مورفیسم ژنتیکی به تفاوت‌های ارثی در توالی‌های DNA بین افراد گفته می‌شود که در بیش از 1% از جمعیت طبیعی مشاهده می‌شود. تکنیک RFLP از این تفاوت‌ها در توالی‌های DNA برای شناسایی و مطالعه تنوع‌های درون‌گونه‌ای و بین‌گونه‌ای استفاده می‌کند.

اصول تکنیک RFLP

اندونوکلئازهای محدود کننده آنزیم‌هایی هستند که DNA را به قطعات کوتاه برش می‌دهند. هر اندونوکلئاز محدود توالی‌های نوکلئوتیدی خاصی را در یک رشته DNA شناسایی کرده و در مکان‌های مشخصی برش می‌زند.

فاصله بین محل‌های برش یک آنزیم اندونوکلئاز محدود کننده خاص در افراد مختلف متفاوت است. به همین دلیل، طول قطعات DNA تولید شده توسط این آنزیم در هر موجود زنده و بین گونه‌های مختلف تفاوت دارد.

چگونه کار می کند؟

RFLP با استفاده از یک سری مراحل انجام می شود که به طور خلاصه در زیر ذکر شده است:

• استخراج DNA

برای شروع، DNA  از خون، بزاق یا نمونه‌های دیگر استخراج و خالص‌سازی می‌شود.

• تکه تکه شدن DNA

DNA  خالص شده با استفاده از اندونوکلئازهای محدود کننده هضم آنزیمی می‌شود. محل‌های شناسایی این آنزیم‌ها معمولاً شامل 4 تا 6 جفت باز هستند. هرچه توالی شناسایی شده کوتاه‌تر باشد، تعداد قطعات تولید شده از هضم آنزیمی بیشتر خواهد بود.

به عنوان مثال، اگر توالی کوتاه GAGC در یک نمونه از DNA تکرار شده باشد، اندونوکلئاز محدود کننده‌ای که این توالی را شناسایی می‌کند، DNA را در هر تکرار الگوی GAGC برش می‌دهد. اگر یک نمونه، توالی GAGC را 4 بار تکرار کند و نمونه دیگر آن را 2 بار تکرار نماید، طول قطعات تولید شده از هضم آنزیمی در هر دو نمونه متفاوت خواهد بود.

• ژل الکتروفورز

قطعات محدود تولید شده در طول قطعه قطعه شدن DNA با استفاده از ژل الکتروفورز تجزیه و تحلیل می شوند.

این قطعات بار منفی دارند و می‌توان آن‌ها را به راحتی با الکتروفورز جداسازی کرد، روشی که مولکول‌ها را بر اساس اندازه و بارشان تفکیک می‌کند. نمونه‌های بریده شده DNA در محفظه‌ای حاوی دو الکترود و ژل الکتروفورتیک قرار می‌گیرند.

هنگامی که یک میدان الکتریکی اعمال می‌شود، قطعات DNA به سمت الکترود مثبت حرکت می‌کنند. قطعات کوچکتر سریع‌تر در ژل حرکت کرده و از قطعات بزرگتر پیشی می‌گیرند. در نتیجه، نمونه‌های DNA به صورت باندهای مجزا روی ژل تفکیک می‌شوند.

• مشاهده باندها

ژل با رنگ‌های فلورسنت، تیمار می‌شود تا نوارهای DNA قابل مشاهده شود.

کاربردهای تکنیک RFLP

RFLP  از زمان اختراع خود برای چندین کاربرد آنالیز ژنتیکی مورد استفاده قرار گرفته است

برخی از این کاربردهای کلیدی RFLP در زیر ذکر شده است:

1. تعیین وضعیت بیماری های ژنتیکی مانند فیبروز کیستیک در فرد؛
2. برای تعیین یا تأیید منبع نمونه DNA مانند آزمایشات پدری یا تحقیقات جنایی؛
3. در نقشه برداری ژنتیکی برای تعیین نرخ های نوترکیبی که فاصله ژنتیکی بین جایگاه ها را نشان می دهد؛
4. شناسایی ناقل یک جهش بیماری زا در یک خانواده.

معایب تکنیک RFLP

از زمان اختراع، تکنیک RFLP به طور گسترده ای از تکنیک های تجزیه و تحلیل ژنوم در علوم پزشکی قانونی، پزشکی و مطالعات ژنتیکی استفاده شده است. با این حال، با ظهور فناوری‌های نسبتاً ساده و ارزان‌تر پروفایل DNA مانند (PCR) این تکنیک تقریباً منسوخ شده است.

تکنیک RFLP به مراحل متعددی نیاز دارد و هفته‌ها طول می‌کشد تا نتایج حاصل شود، در حالی که تکنیک‌هایی مانند PCR می‌توانند توالی‌های DNA هدف را در عرض چند ساعت تکثیر دهند.

علاوه بر این، RFLP به یک نمونه DNA بزرگ نیاز دارد که جداسازی آن می‌تواند فرآیندی پرزحمت و زمان‌بر باشد. اما PCR می تواند مقادیر بسیار کمی از DNA را در عرض چند ساعت تکثیر کند.

به دلیل نکات فوق، تکنیک PCR تا حد زیادی جایگزین RFLP در بسیاری از کاربردهایی شده است که به تعیین توالی DNA مانند آزمایش پدری یا آنالیز نمونه در  پزشکی قانونی نیاز دارند.

علاوه بر این، شناسایی پلی مورفیسم های تک نوکلئوتیدی در پروژه ژنوم انسانی تقریباً جایگزین نیاز به RFLP در تجزیه و تحلیل وضعیت بیماری شده است.

همچنین بخوانید:

منبع

مترجم: هلیا غفوریان
ویراستاری: فریماه حاجی حبیب یزدی