Real-time PCR در تشخیص بیماری

فهرست مطالب نمایش

مقدمه‌ای بر Real-time PCR

سلول ها در تمام ارگانیسم ها بیان ژن را به وسیله ی تبادل رونوشت ژن ها (transcripts) تنظیم می کنند. میزان بیان ژن در یک سلول را می توان با تعداد کپی های رونوشت RNA آن ژن که در نمونه وجود دارد، اندازه گیری نمود. به منظور شناسایی و تعیین کمیت قوی بیان ژن از مقادیر کم RNA ، تکثیر رونوشت ژن ضروری است. PCR روش رایج برای تکثیر DNA می باشد؛ برای PCR مبتنی بر RNA، نمونه ی RNA ابتدا باید با رونوشت برداری معکوس توسط آنزیم reverse transcriptase به cDNA (complementary DNA) تبدیل شود.

Real-time PCR یا qPCR تکثیر DNA (یا cDNA) را در حین واکنش PCR رصد می کند؛ برخلاف PCR conventional که در انتهای واکنشPCR ، DNAتکثیر شده را ارزیابی می کند. در Real-time PCR علاوه بر تمام موادی که در PCR استفاده می شود، یک ماده ای که با فلوروفور مشخص شده نیز به مواد قبلی اضافه می شود که شامل سنسورهایی است که میزان فلورسنس فلوروفور را بعد از برانگیخته شدن با طول موج مورد نیاز، اندازه گیری کرده و امکان سنجش نرخ تولید محصول تکثیر شده را فراهم می آورد.

دیتای تولید شده به وسیله یک نرم افزار کامپیوتری آنالیز می گردد تا میزان بیان ژن (یا تعداد نسخه ی mRNA) را در چندین نمونه محاسبه نماید. این محاسبه و اندازه گیری بعد از هر سیکل تکثیر اتفاق می افتد، به دلیل رصد و سنجش محصولات تکثیر در هر سیکل، این روش Real-time PCR نام گرفته است. Real-time PCR در یک دستگاه thermal cycler انجام می پذیرد که قابلیت روشن ساختن هر نمونه با یک پرتو نور با حداقل یک طول موج مشخص را دارد و همچنین قادر به شناسایی فلورسنس ساطع شده به وسیله ی فلوروفور برانگیخته نیز می باشد.

کاربردهای فراوانی را می توان برای Real-time PCR نام برد. این روش به طور رایجی هم در تشخیص و هم در حیطه ی تحقیقات کاربرد دارد. از کاربردهای Real-time PCR می توان به بررسی بیان ژن در تحقیقات، تعیین ژنوتیپ و کمیت پاتوژن های ویروسی آلوده کننده ی انسان در تشخیص، تعیین لود میکروبی در غذاها یا مواد گیاهی در صنعت و همچنین تشخیص ارگانیسم های تراریخته یا GMO (genetically modified organisms ) اشاره کرد.

در مورد دستگاه Real-time PCR بیشتر بدانید

کاربرد Real-time PCR در تشخیص بیماری

Real-time PCR (PCR کمی یا qPCR) یک روش تثبیت شده برای تشخیص، سنجش و تمایز انواع عوامل مختلف عفونی در حوزه های بالینی به شمار می رود. در بسیاری از حوزه های بیماری های عفونی، Real-time PCR جایگزین یا مکمل روش های تشخیصی کلاسیک مانند کشت و Immunoassay شده است.

Real-time PCR با شناسایی مستقیم DNA یا RNA عامل پاتوژن، تشخیص سریع و با اختصاصیت بالا را فراهم می آورد، که می تواند به بهبود درمان و یا حتی درمان های گزینشی برای فرد بیمار منجر شود. ویروس ها می توانند انسان ها را به طور منفرد آلوده کرده و یا چندین ویروس به طور همزمان عامل عفونت در یک فرد باشند، که وجود چندین ویروس به صورت همزمان تشخیص را برای روش های کلاسیک دشوار کرده و می تواند منجر به خطا در درمان و پیش آگهی بیماری شود.

با استفاده از Real-time PCR در تشخیص، تعیین ژنوتیپ و تعیین کمیت یک ویروس مانند هپاتیت B امکان پذیر می شود. درجه ی عفونت که با تعداد کپی های ژنوم ویروس در هر واحد از بافت بیمار تعیین می شود، در بسیاری از موارد اهمیت بالایی دارد؛ برای مثال، احتمال دوباره فعال شدن herpes simplex virus به تعداد نورون های آلوده شده در گانگلیون بستگی دارد.

این تعیین کمیت و تعداد به واسطه ی Real-time PCR در تشخیص، می تواند با فرایند reverse transcription اتفاق بیفتد و یا بدون این فرایند، همچنین از زمانی که ویروس (در هر مرحله ای از سیکل زندگی خود) در ژنوم انسان ادغام شود می توان تعیین کمیت را انجام داد.

به طور مثال ادغام ویروس HPV (human papillomavirus) در ژنوم انسان، که بعضی از واریانت های آن با ظهور سرطان دهانه رحم همراهی دارند. از دستاوردهای دیگر Real-time PCR در تشخیص، می توان امکان تعیین کمیت و ارزیابی ویروس CMV (human cytomegalovirus) را نام برد، که این ویروس در بیمارانی که به دنبال پیوند عضو یا مغزاستخوان دچار سرکوب سیستم ایمنی شده اند، دیده می شود.

در Real-time PCR دو استراتژی برای سنجش محصولات PCR وجود دارد، یک استفاده از رنگ های DNA غیر اختصاصی که بین دو رشته ی DNA اینترکاله می شوند مانند سایبرگرین و دو پروب های الیگونوکلئوتیدی اختصاصی که با فلورسنت نشاندار شده اند. این دو روش به طور موازی و هم زمان با هم توسعه یافته اند.

در روش اول رنگ غیر اختصاصی به همه ی محصولات PCR دو رشته ای متصل می شود، که شامل محصولات غیراختصاصی نیز می باشد، مانند دایمر پرایمرها. این خاصیت غیراختصاصی بودن، پتانسیل مداخله در رصد سیگنال های ساطع شده از توالی هدف را دارد. اما Real-time PCR با استفاده از آنالیز دمای ذوب (melting temperature) توالی های تکثیر شده، امکان شناسایی محصول PCR اختصاصی را فراهم می آورد.

از آنجایی که رنگ غیراختصاصی به DNA دو رشته ای متصل می گردد، زمانی که نصف یک محصول PCR دورشته ای از هم باز می شود، مقدار بسیار زیادی سیگنال در آن دمای T_m محصول ساطع می شود. نرم افزار از نمودار حاصل از افت سیگنال مشتق گرفته و آن را به صورت پیک های قله مانندی نمایش می دهد که به آن نمودار melt curve گفته می شود.

بنابراین انتظار می رود که به تعداد نوع محصول PCR در نمودار melt curve، پیک داشته باشیم. نمودار melt curve امکان شناسایی محصول اختصاصی را با توجه به T_m محصول فراهم می آورد. البته نمودار melt curve بیشتر در مواردی که از رنگ غیراختصاصی در Real-time PCR استفاده می شود کاربرد داشته و با استفاده از پروب های اختصاصی در Real-time PCR از نمودار melt curve بی نیاز می شویم.

پروب (Probe)

qPCR مبتنی بر پروب از خاصیت 5ʹ-3ʹ اگزونوکلئازی آنزیم Taq polymerase برای تخریب یک پروب نشاندار شده با فلورسنت که اختصاصی برای ژن هدف است، استفاده کرده و تکثیر DNA را در هر سیکل PCR می سنجد. از آنجایی که qPCR مبتنی بر پروب معمولا اختصاصی تر از qPCR مبتنی بررنگ است و شناسایی محصولات غیر اختصاصی از جمله دایمر پرایمر را بسیار کاهش می دهد، این روش در آزمایشات تشخیصی qPCR رایج تر است.

طراحی پروب به روش های مختلفی انجام می شود، اما متداول ترین نوع آن، پروب های هیدرولیزی مانند پروب TaqMan می باشد که در این نوع پروب یک گزارشگر فلوروفر (Reporter) در انتهای5’ و یک خاموش کننده یا پذیرنده فلوروفور (Quencher) در انتهای 3’ به یک قطعه ی الیگونوکلئوتیدی کوتاه و مکمل با توالی هدف، اتصال می یابد.

فلوروفور یک مولکول فلورسنس است که انرژی نور را در یک طول موج مشخص جذب کرده و آن را در یک طول موج بلندتر بازنشر می کند. اگر یک مولکول فلوروفر گزارشگر انرژی نور را جذب کند سطح انرژی آن به حالت برانگیخته افزایش می یابد، بازگشت به سطح انرژی اولیه با تابش نور همراه است. انرژی نور ساطع شده می تواند به یک فلوروفر خاموشگر یا پذیرنده در صورتی که دو فلوروفور در مجاورت یک دیگر باشند، انتقال یابد. انتقال انرژی برانگیخته از یک گزارشگر فلورسنس به یک خاموشگر FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) نامگذاری می شود.

زمانی که پروب سالم است، FRET اتفاق می افتد و تابش فلورسنس فلوروفور گزارشگر به وسیله ی فلوروفر خاموشگر جذب می شود، زمانی که توالی هدف وجود داشته باشد، پروب نشاندار با فلورسنت به پایین دست یکی از پرایمرها متصل می شود و در طی مرحله ی طویل سازی qPCR توسط فعالیت نوکلئازی آنزیم Taq DNA polymerase تخریب می شود.

تخریب پروب به وسیله ی Taq polymerase در حین qPCR فلوروفورهای گزارشگر و خاموش کننده را از هم جدا می کند و در نتیجه تابش فلورسنس وابسته به تکثیر، اتفاق می افتد. qPCR بر مبنای پروب، با استفاده از رنگ فلورسنت منحصر به فرد برای هر پروب اختصاصی توالی، امکان سنجش چندین توالی هدف را در یک واکنش واحد فراهم می کند که از این خاصیت برای انجام Real-time PCR به صورت Multiplex استفاده می شود. در این روش باید به تعداد توالی هدف، پروب اختصاصی توالی با رنگ های فلورسنت مختلف طراحی شود.

یکی از کاربرد های بالینی multiplex Real-time PCR در تشخیص ویروس های تنفسی است. در دسامبر 2019 شیوع یک بیماری با مجموعه ی علائم وخیم، شامل تب، عارضه ی شدید تنفسی و ذات الریه ی مزمن،که در نهایت منجر به نارسایی تنفسی و مرگ می شد، در شهر یوهان چین گزارش شد.

در فوریه 2020، سازمان بهداشت جهانی عامل این بیماری را که از خانواده ی SARS-CoV بود، COVID-19 که مخفف” بیماری کرونا ویروس 2019″ بود نام نهاد و آن را یک بیماری بسیار مسری و همه گیر اعلام کرد. کرونا ویروس ها با ژنوم RNA تک رشته و بزرگ با طول 26 تا 32 کیلو باز مشخص شده است.

یکی از دغدغه های مهم در پاندمی COVID-19 نیاز به یک روش تشخیصی دقیق، کارآمد، مقرون به صرفه و قابل دسترس برای شناسایی کرونا ویروس و آنتی بادی های همراه آن در بیماران مبتلا بوده است.در حال حاضر، کیت های تجاری موجود برای تشخیص کرونا ویروس به طور کلی به دو دسته ی ویروسی و تست های آنتی بادی تقسیم می شوند. تست ویروسی مبتنی بر تشخیص RNA ی ویروسی با روش های مبتنی بر Real-Time PCR است.

تست آنتی بادی بر اساس روش های سرولوژیکی و Immunoassay ها می باشد که آنتی بادی های اختصاصی را که در نتیجه ی ابتلای فرد به ویروس تولید شده اند، شناسایی می کند. تست های تشخیصی ویروسی در مقایسه با روش های سرولوژیکی که تنها زمانی که آنتی بادی تولید شده است امکان تشخیص عامل بیماری زا را دارند، به طور قابل توجه ای مفیدتر هستند چرا که تست های سرولوژیکی تنها در مورد عفونت گذشته ی فرد اطلاع داده و قادر به تعیین وضعیت فعلی ویروس در بیمار نیستند.

بنابراین qPCR مبتنی بر هیبریداسیون پروب، پرکاربردترین روش در تشخیص RNA ویروس ها می باشد. به دلیل حساسیت، اختصاصیت، مطمئن بودن و قابلیت Multiplex ، امروزه qRT-PCR روش استاندارد طلایی برای شناسایی کروناویروس است.

qRT-PCR به دو روش انجام می گیرد:

تک مرحله ای (one-step)
دو مرحله ای (two-step)

در واکنش تک مرحله ای، سنتز cDNA و qPCR به طور هم زمان در یک واکنش انجام می گیرند. بنابراین فرد آزمون گر می تواند تمام مواد لازم برای واکنش اعم از سنتز cDNA و Real-Time PCR را تنها در یک واکنش ترکیب کرده و با ارائه برنامه دمایی و زمانی که در آن ابتدا در واکنش RNA را cDNA تبدیل شده و سپس بلافاصله تکثیر می شوند را در دستگاه PCR اعمال کند.

شرکت های بسیاری کیت های One-step RT-qPCR مبتنی بر هیبریداسیون پروب برای تشخیص کرونا تولید کرده اند. کیت های One-step qRT-PCR و پروب TaqMan پلتفرم های توصیه شده از طرف CDC (مراکز کنترل و پیشگیری از بیماری های ایالات متحده) برای استفاده هستند.

پروب و آزادسازی سیگنال — اتصال پروب و سپس آزاد سازی سیگنال پس از تخریب آن

اصول طراحی پروب برای qPCR

چهار اصل مهم در طراحی پروب برای qPCR وجود دارد:

موقعیت (Location): به طور ایده ال پروب باید در نزدیکی یکی از پرایمرهای Forward یا Reverse باشد (فاصله 4 تا 15 جفت بازی از انتهای 3′ پرایمر تا انتهای 5′ پروب) اما نباید با ناحیه ی اتصال پرایمر در همان رشته همپوشانی داشته باشد.
دمای T_m: دمای T_m پروب باید حدود 10 درجه بالاتر از دمای T_m پرایمر باشد، اگر دمای T_m پایین باشد ، احتمال اتصال پروب به توالی هدف پایین خواهد آمد که در این صورت پرایمرها قبل از آن که پروب اتصال یابد محصول را تکثیر کرده که این امر موجب به خطر افتادن اختصاصیت خواهد شد چرا که از آنجایی که تمام توالی های هدف با پروب اشباع نشده اند، سیگنال فلورسنس کاهش یافته و میزان واقعی توالی هدف موجود در نمونه به درستی به دست نخواهد آمد.
درصد GC: مانند پرایمرها، درصد GC پروب نیز در محدوده ی35 تا 65 درصد می باشد. نکته مهم آن است که می بایست از گذاشتن سه نوکلئوتید گوانین و یا بیشتر در یک ردیف پشت هم و یا قرار دادن نوکلئوتید گوانین در انتهای 5’ پروب در مجاورت رنگهای گزارشگر مبتنی بر فلورسئین (FAM، JOE، Cal Gold، Vic و غیره) خودداری کرد.
انتخاب مناسبQuenche r و Reporter: در این زمینه نکات قابل توجهی برای سنجش qPCR مبتنی بر پروب وجود دارد که می بایست در نظر گرفته شود:

سازگاری رنگ با دستگاه (Instrument compatibility): انتخاب رنگ گزارشگر مناسب برای آنالیز qPCR به نوع ابزاری که استفاده می کنید و سازگاری رنگ با دستگاه بستگی دارد.

Multiplexing: برای انجام مالتی پلکس، هر هدف باید با رنگ گزارشگر جداگانه شناسایی شود همچنین کمترین همپوشانی طیفی را نیز با هم داشته باشند. به عنوان یک قانون کلی، رنگی با سیگنال قوی مانند FAM را برای رونوشت هایی با تعداد کم کپی می توان انتخاب کرد. سپس از فلوروفورهای سیگنال پایین‌تر برای رونوشت‌های فراوان‌تر استفاده کرد.

Quenchers: انواع مختلف Quencher ها شامل:

Quencher های فلورسانس تترا متیل رودامین (TAMRA™):

نوعی از خاموش کننده های فلورسنت هستند که انرژی خود را به صورت نور فلورسانسی بازتاب می دهند که قابلیت تشخیص ندارد. رنگ TAMRA یک خاموش کننده موثر برای فلوروفورها با حداکثر انتشار کمتر از 560 نانومتر است. رنگ هایی با انتشار طول موج بیشتر به طور موثر توسط TAMRA خاموش نمی شوند.

خواص جذب نور TAMRA و همپوشانی طیفی با چندین فلوروفور معمولی، از جمله FAM، HEX، TET و JOE، آن را به عنوان یک خاموش کننده محبوب برای طراحی پروب ها تبدیل کرده است. با این وجود، TAMRA دارای فلورسانس خاص خود است که تجزیه و تحلیل داده ها را به دلیل تداخل بین کانال ها پیچیده می کند. فلورسانس پس زمینه غیر اختصاصی پروب با چنین خاموشگرهایی می تواند حساسیت روش TaqMan را کاهش دهد.

مولکول های غیر فلورسنت (DABCYL، Black Hole Quencher™ (BHQ™):

این دسته از خاموشگرها که به اصطلاح خاموشگرهای تاریک (Dark quencher) نیز نامیده می شوند انرژی خود را به جای نور به صورت گرما بازتاب می دهند و نور ساطع نمی کنند، که امکان استفاده از چندین رنگ گزارشگر با یک خاموش کننده را فراهم می کنند. این ویژگی تداخل بین سیگنال ها را کاهش داده و تشخیص رنگ گزارشگر را ساده می کند همچنین امکان استفاده از چندین رنگ به صورت هم زمان در واکنش های مولتی پلکس را نیز افزایش می دهد.

علاوه بر این، رنگ‌های BHQ™ دارای جذب وسیعی در محدوده 480-580 نانومتر (BHQ-1)، 559-670 نانومتر (BHQ-2) و 620-730 نانومتر (BHQ-3) هستند که امکان استفاده از آن ها را برای گزارشگرهای مختلف فراهم خواهد کرد.

جدول زیر خاموشگر مخصوص هر گزارشگر را به همراه طول موج و رنگ نور فلورسنس ساطع شده نشان می دهد.

Reference

https://international.neb.com/applications/dna-amplification-pcr-and-qpcr/qpcr-and-rt-qpcr/probe-based-qpcr-and-rt-qpcr#:~:text=Probe%2Dbased%20quantitative%20PCR%20(qPCR,each%20cycle%20of%20a%20PCR.
https://clinical.r-biopharm.com/technologies/pcr/
Kralik P, Ricchi M. A Basic Guide to Real Time PCR in Microbial Diagnostics: Definitions, Parameters, and Everything. Front Microbiol. 2017 Feb 2;8:108. doi: 10.3389/fmicb.2017.00108. PMID: 28210243; PMCID: PMC5288344.
Huang Q, Chen D, Du C, Liu Q, Lin S, Liang L, Xu Y, Liao Y, Li Q. Highly multiplex PCR assays by coupling the 5′-flap endonuclease activity of TaqDNA polymerase and molecular beacon reporters. Proc Natl Acad Sci U S A. 2022 Mar 1;119(9):e2110672119. doi: 10.1073/pnas.2110672119. PMID: 35197282; PMCID: PMC8892341.
Artika, I.M.; Dewi, Y.P.; Nainggolan, I.M.; Siregar, J.E.; Antonjaya, U. Real-Time Polymerase Chain Reaction: Current Techniques, Applications, and Role in COVID-19 Diagnosis. Genes2022, 13, 2387. https://doi.org/10.3390/genes13122387.
Mayer, L.M., Kahlert, C., Rassouli, F. et al. Impact of viral multiplex real-time PCR on management of respiratory tract infection: a retrospective cohort study. Pneumonia 9, 4 (2017). https://doi.org/10.1186/s41479-017-0028-z
Takahashi M, Tehseen M, Salunke R, Takahashi E, Mfarrej S, Sobhy MA, Alhamlan FS, Hala S, Ramos-Mandujano G, Al-Qahtani AA, Alofi FS, Alsomali A, Hashem AM, Khogeer A, Almontashiri NAM, Lee JM, Mon H, Sakashita K, Li M, Kusakabe T, Pain A, Hamdan SM. Quick and Easy Assembly of a One-Step qRT-PCR Kit for COVID-19 Diagnostics Using In-House Enzymes. ACS Omega. 2021 Mar 15;6(11):7374-7386. doi: 10.1021/acsomega.0c05635. PMID: 33778250; PMCID: PMC7986002.
https://eu.idtdna.com/pages/education/decoded/article/designing-pcr-primers-and-probes