RT-PCR: تعریف، اساس، آنزیم‌ها، انواع، مراحل، موارد استفاده

RT-PCR چیست؟

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) یک تکنیک تکثیر اسید نوکلئیک وابسته به دما است که برای تکثیر DNA یا RNA در شرایط آزمایشگاهی آنزیمی استفاده می‌شود.

این ابزار که توسط Kary Mullis و همکارانش در اواسط دهه 1980 توسعه یافت، یک ابزار بسیار قدرتمند و مهم در زیست شناسی مدرن – زیست شناسی مولکولی و ژنتیک است. این اصل هیبریداسیون اسید نوکلئیک را با اصل تکثیر اسید نوکلئیک ترکیب می‌کند. با استفاده از این تکنیک غیر مبتنی بر محیط کشت، می‌توانیم میلیاردها نسخه از یک بخش از DNA یا RNA را در مدت زمان بسیار کوتاهی تولید کنیم.

از زمان توسعه آن، تغییرات متعددی انجام شده است و اکنون انواع مختلفی از تکنیک‌های PCR برای اهداف مختلف در دسترس هستند. PCR ترانس کریپتاز معکوس و PCR کمی (qPCR) رایج‌ترین انواع PCR هستند.

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز ترانس کریپتاز معکوس (RT-PCR)، نوعی تکنیک PCR است که RNA را در شرایط آزمایشگاهی به صورت آنزیمی تکثیر می‌کند.

این تنها نوع PCR است که می‌تواند RNA را تکثیر کند. در این روش علاوه بر سایر اجزای اصلی PCR، از آنزیم ترانس کریپتاز معکوس نیز استفاده می‌شود.

ابتدا RNA نمونه در رونویسی معکوس به DNA مکمل (cDNA) تبدیل می‌شود که توسط آنزیم ترانس کریپتاز معکوس کاتالیز می‌شود. سپس از این مولکول‌های cDNA به عنوان الگوی تکثیر در فرایند PCR استفاده می‌شود.

RT-PCR برای تجزیه و تحلیل mRNA یا micro RNA و مطالعه بیان ژن استفاده می‌شود.

اهداف RT-PCR

• برای تکثیر بخش خاصی از RNA، که منجر به میلیاردها نسخه از یک بخش RNA می‌شود.
• برای تشخیص برخی عفونت‌ها، ژن‌ها و مطالعه بیان ژن.

اساس RT-PCR

RT-PCR فرایند رونویسی معکوس را با فرایند PCR معمولی ترکیب می‌کند. RNA نمونه ابتدا توسط آنزیم ترانس کریپتاز معکوس در فرایند رونویسی معکوس به DNA دو رشته‌ای (DNA مکمل) تبدیل می‌شود. سپس cDNA را می‌توان از نظر حرارتی به دو الگوی DNA تک ‌رشته‌ای تجزیه کرد. در این الگوهای ssDNA، پرایمرها می‌توانند بر اساس اصل هیبریداسیون اسید نوکلئیک به توالی‌های مکمل خود آنیل شوند.

سپس DNA پلیمراز با افزودن متوالی نوکلئوتیدها به انتهای 3، پرایمر را طویل می‌کند و dsDNA را مطابق اصل همانندسازی DNA تولید می‌کند. این سه فرایند، دناتوراسیون، آنیلینگ و طویل شدن، به صورت چرخه‌ای تکرار می‌شوند و دمای واکنش را تنظیم می‌کنند و منجر به تولید میلیون‌ها نسخه از cDNA می‌شوند.

موارد الزامی (آنزیم) RT-PCR

1. نمونه اسید نوکلئیک (نمونه RNA)

RNA نمونه‌ای برای RT-PCR است، که این برخلاف سایر تکنیک‌های PCR است که از DNA به عنوان نمونه استفاده می‌کنند. اغلب mRNA به عنوان نمونه استفاده می‌شود. RNA قبل از تکثیر به cDNA تبدیل می‌شود.

2. آنزیم ترانس کریپتاز معکوس

آنزیمی است که تشکیل رشته‌های DNA مکمل (cDNA) از رشته RNA را کاتالیز می‌کند. این آنزیم، DNA پلیمراز وابسته به RNA نیز نامیده می‌شود و مسئول معکوس کردن سنترال دوگما است. این جزء اصلی RT-PCR است زیرا RNA نمونه را برای تکثیر به cDNA تبدیل می‌کند.

3. آنزیم DNA پلیمراز

DNA پلیمرازها آنزیم‌هایی هستند که سنتز رشته‌های DNA مکمل را با مونتاژ نوکلئوتیدها به ترتیب مطابق با رشته الگو کاتالیز می‌کنند. Taq DNA polymerase، آنزیم DNA پلیمراز استخراج شده از باکتری Thermus aquaticus، گسترده‌ترین DNA پلیمراز است؛ زیرا از نظر حرارتی پایدار است و پس از چرخه مکرر گرمایش و سرد کردن به فعالیت خود ادامه می‌دهد.

4. پرایمرها (پرایمرهای الیگو (dT)، پرایمرهای رندم و پرایمرهای توالی خاص)

سه نوع پرایمر مختلف در RT-PCR استفاده می‌شود.

پرایمرهای تصادفی

اینها توالی‌های کوتاه تک‌ رشته‌ای ساخته شده از 6 تا 8 نوکلئوتید هستند که در محل مکمل RNAها با یا بدون poly(A) برای سنتز cDNA با استفاده از ترانس کریپتاز معکوس متصل می‌شوند.

پرایمرهای الیگو (dT)

آنها اولیگونوکلئوتیدها هستند، عمدتاً از 12 تا 18 نوکلئوتید تشکیل شده اند و حاوی یک بخش از دئوکسی تیمیدین تکرار شونده (dT) هستند که در دم polyA mRNA متصل می‌شود.

پرایمرهای توالی خاص

اینها توالی‌های تک رشته‌ای کوتاهی از نوکلئوتیدها هستند که به ناحیه خاص مورد نظر RNA نمونه متصل می‌شوند. این نوع پرایمر بیشتر در RT-PCR یک مرحله‌ای استفاده می‌شود.

5. دئوکسی نوکلئوتید تری فسفات

تری فسفات‌های دئوکسی نوکلئوتید (dNTPs) نوکلئوتیدهایی هستند که به طور مصنوعی سنتز می‌شوند که به عنوان بلوک‌های ساختمانی برای سنتز cDNA و رشته‌های cDNA جدید در طول تکثیر عمل می‌کنند. برای این منظور چهار dNTP مختلف استفاده می‌شود. دئوکسی آدنوزین‌تری‌فسفات (dATP)، دئوکسی گوانوزین تری فسفات (dGTP)، دئوکسی تیمیدین تری فسفات (dTTP) و دئوکسی سیتیدین تری فسفات (dCTP).

6. بافرهای PCR و سایر مواد شیمیایی

7. ترموسایکلر (دستگاه PCR)

انواع RT-PCR

بر اساس اینکه مراحل رونویسی معکوس و تکثیر در یک واکنش منفرد (یا تیوب) یا در دو واکنش جداگانه (یا تیوب‌ها) رخ دهد، RT-PCR را می‌توان به دو دسته طبقه‌بندی کرد:

1. تک مرحله‌ای RT-PCR

این یک نوع RT – PCR است که در آن رونویسی معکوس و واکنش‌های تکثیر در یک لوله یا تیوب رخ می‌دهد. تمام اجزای مورد نیاز در یک لوله اضافه می‌شوند. ابتدا رونویسی معکوس رخ می‌دهد و cDNA را تشکیل می‌دهد که سپس در یک فرایند PCR تکثیر می‌شود.

مزایای RT-PCR یک مرحله‌ای نسبت به RT-PCR دو مرحله‌ای

4. این روش راه‌اندازی ساده و آسانی دارد.
5. دقت و ویژگی بالاتری دارد.
6. احتمال آلودگی کمتری دارد.
7. این یک روش ارزان‌تر و سریع‌تر است.

معایب RT-PCR یک مرحله‌ای نسبت به RT-PCR دو مرحله‌ای

1. به دلیل استفاده از چندین ماده شیمیایی در یک لوله واکنش، الگوهای کمتری را در هر مخلوط واکنش تشخیص می‌دهد.
2. به دلیل تشخیص کمتر الگو، برای شروع به یک الگوی بزرگ‌تر نیاز دارد.
3. اجازه ذخیره سازی و تجزیه و تحلیل بیشتر cDNA تشکیل شده در طول واکنش را نمی‌دهد.
4. احتمال اتصال پرایمر – دایمر و غیراختصاصی (non–specific) بیشتر است.
5. احتمال شکست واکنش نسبتاً زیاد است.

RT-PCR دو مرحله‌ای

این روش نوع دیگری از RT-PCR است که در آن رونویسی معکوس و فرایند تکثیر در دو لوله جداگانه انجام می‌شود. در لوله اول، یک واکنش رونویسی معکوس انجام می‌شود و cDNA تولید می‌کند. سپس این cDNAها به لوله دیگری منتقل می‌شوند که در آنجا مخلوط PCR اضافه می‌شود و cDNAها تکثیر می‌شوند.

مزایای RT-PCR دو مرحله‌ای نسبت به RT-PCR تک‌ مرحله‌ای

1. این روش به ما اجازه می‌دهد تا cDNA تشکیل شده توسط رونویسی معکوس را ذخیره کنیم.
2. راندمان، دقت و قابلیت اطمینان بالاتری دارد و الگوهای بزرگ‌تری را در هر مخلوط واکنش تشخیص می‌دهد.
3. در مقایسه با روش تک‌مرحله‌ای، احتمال شکست واکنش، اتصال غیر اختصاصی و پیوند پرایمر – دایمر کمتر است.

معایب RT-PCR دو مرحله‌ای نسبت به RT-PCR تک ‌مرحله‌ای

1. احتمال آلودگی بیشتر است.
2. فرایندی پیچیده‌تر و خسته‌کننده‌تر است که به منابع بیشتر و یک فرد آموزش‌دیده نیاز دارد.

مراحل/روند RT-PCR

فرایند اصلی را می‌توان به طور کلی به دو مرحله طبقه‌بندی کرد. رونویسی و تکثیر معکوس این روش همچنین در RT – PCR یک‌ مرحله‌ای و دو مرحله‌ای متفاوت است. اما مراحل کلی مربوط به هر دو نوع یکسان است و در چهار مرحله خلاصه می‌شود. مرحله آماده سازی، رونویسی معکوس، تکثیر و مرحله تجزیه و تحلیل محصول، یعنی:

1. مرحله مقدماتی/آماده سازی

این مرحله اولیه است که در آن استخراج RNA انجام می‌شود و تمام مخلوط واکنش آماده می‌شود. ابتدا، همه مواد مرتب می‌شوند، اقدامات ایمنی انجام می‌شود، منطقه آماده سازی واکنش PCR تمیز می‌شود، تمام معرف‌ها به دمای کار می‌رسند، و نمونه استخراج یا از انبار آورده می‌شود.

در RT-PCR یک‌ مرحله‌ای، RNA نمونه، آنزیم ترانس کریپتاز معکوس، RNase H، پرایمرها، DNA پلیمراز، dNTPs، بافرها و همه اجزای دیگر به مقدار مشخص و از پیش محاسبه شده در یک لوله واکنش اضافه می‌شوند. سپس لوله برای پردازش بیشتر در یک ترموسایکلر بارگذاری می‌شود.

در RT-PCR دو مرحله‌ای، RNA نمونه، رونوشت معکوس، RNase H، پرایمرها، dNTPs و سایر بافرها و مواد شیمیایی برای رونویسی معکوس در یک لوله اضافه می‌شوند. سپس لوله تحت دمای مشخصی در ترموسایکلر قرار می‌گیرد که در آن cDNA تشکیل می‌شود.

2. رونویسی معکوس

این مرحله اولیه است که در آن RNA به cDNA تبدیل شده و سپس تکثیر می‌شود.

تمام مخلوط واکنش، از جمله ترانس کریپتاز معکوس، RNase H، مخلوط dNTPs، پرایمرها، آب فاقد نوکلئاز، بافر رونویسی معکوس، و سایر اجزا در RT-PCR یک‌ مرحله‌ای و DNA پلیمراز و سایر اجزای تکثیر در روش دو مرحله‌ای در یک لوله اضافه می‌شود و در دمای 40 تا 50 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه تا 30 دقیقه در یک ترموسایکلر قرار می‌گیرد. در این دما، پرایمر به محل مربوطه نمونه RNA متصل می‌شود و آنزیم ترانس کریپتاز معکوس با افزودن dNTP های آزاد، cDNA را سنتز می‌کند.

3. تکثیر

این مرحله مشابه فرایند تکثیر سایر تکنیک‌های PCR برای تکثیر DNA است. در یک RT-PCR یک‌ مرحله‌ای، همان مخلوط واکنش تحت یک فرایند تکثیر قرار می‌گیرد. در همین زمان، در RT-PCR دو مرحله‌ای، cDNA جدا شده و در لوله دیگری قرار می‌گیرد که DNA پلیمراز، پرایمرها، بافر PCR، dNTPs و سایر مواد شیمیایی اضافه می‌شوند. سپس لوله برای تکثیر در یک ترموسایکلر قرار می‌گیرد.

مرحله تکثیر شامل دناتوره شدن، آنیلینگ و طویل شدن است که به صورت دوره‌ای یکی پس از دیگری برای تعداد معینی از چرخه‌های از پیش برنامه‌ریزی‌شده توسط کاربر اتفاق می‌افتد.

4. مرحله تجزیه و تحلیل محصول

این مرحله نهایی است که در آن مخلوط واکنشی که در معرض PCR قرار گرفته است برای تأیید اینکه تکثیر مورد نظر حاصل شده است یا خیر، تجزیه و تحلیل می‌شود. روش الکتروفورز ژل بیشتر برای آنالیز محصول استفاده می‌شود. در RT-PCR بلادرنگ (real-time RT-PCR)، نیازی به این مرحله اضافی نیست.

کاربردهای RT-PCR

مطالعه بیان ژن

روش سنتی نورثرن بلات (Northern Blot) به نمونه mRNA بزرگ‌تری برای تجزیه و تحلیل و مطالعه بیان ژن نیاز دارد. با این حال، با استفاده از RT-PCR، می‌توانیم نمونه mRNA را تکثیر کنیم و توالی نوکلئوتیدها را مطالعه کنیم، بنابراین بیان ژن را تجزیه و تحلیل کنیم. این روش در مطالعه و شناسایی ژن‌های مقاوم به چند دارو و بیان آنها در پاتوژن‌ها استفاده می‌شود.

شناسایی گونه‌های ناشناخته

RT-PCR برای شناسایی ویروس‌هایی مانند HIV، ویروس سارس، ویروس دنگی، HCV و غیره استفاده می‌شود. علاوه بر این، سایر میکروارگانیسم‌ها و حتی ارگانیسم‌های عالی‌تر با مطالعه rRNA و mRNA آنها شناسایی می‌شوند.

تشخیص بیماری‌های عفونی

تشخیص انواع عفونت‌های ویروسی، عفونت باکتریایی، عفونت قارچی و انگلی، سلول‌های سرطانی و بیماری‌های ژنتیکی با استفاده از تکنیک RT-PCR در آزمایشگاه‌های بالینی انجام می‌شود.

جای‌گذاری ژن و مطالعات ژن درمانی

RT-PCR برای تهیه cDNA از mRNA یوکاریوتی که فاقد اینترون است و می‌تواند به پروکاریوت‌ها وارد شود، استفاده می‌شود. RT-PCR در نظارت بر نتیجه جای‌گذاری ژن و ژن درمانی استفاده می‌شود. این روش‌ها قرار است بیان ژن و کد یک پروتئین خاص را نشان دهند، بنابراین انواع خاصی از توالی mRNA را ترجمه می‌کنند. این توالی mRNA خاص را می‌توان با استفاده از RT-PCR آنالیز کرد.

مطالعه جهش و سلول‌های سرطانی

RT-PCR می‌تواند آلل‌های جهش یافته بافتی را شناسایی و ازلحاظ کمی مشخص کند. همچنین می‌تواند هر گونه تغییر نامطلوب در توالی mRNA و mRNAهای منحصر به فرد را که تنها توسط انواع مختلف سلول‌های سرطانی در بدن ما تولید می‌شوند، شناسایی کند.

ابزارهای مهندسی ژنتیک و مطالعه ویروسی

RT-PCR در مهندسی ژنتیک برای تجزیه و تحلیل DNAهای اصلاح شده و RNAهای رونویسی شده آنها و تکثیر RNA هدف استفاده می‌شود.

مزایای RT-PCR

1. این یک روش بسیار سریع برای تکثیر RNA است و می‌تواند میلیون‌ها نسخه از mRNA را به صورت آنزیمی در مدت زمان بسیار کوتاهی تولید کند.
2. عملکرد آن بسیار ساده است. این یک فرایند نیمه اتوماتیک است و توسط یک ترموسایکلر بدون دخالت انسان تنظیم می‌شود.
3. ویژگی و حساسیت بسیار بالایی دارد؛ اما در عین حال مقرون به صرفه است.
4. این یک روش بسیار دقیق برای شناسایی ویروس‌های RNA دار و عفونت توسط آنها است. ویروس‌های RNA دار را می‌توان تا سطح سویه‌ها طبقه بندی کرد. این روش زمان شناسایی ویروس‌های RNA دار و عفونت‌های ویروسی را کوتاه کرده است.
5. این روش می‌تواند مقدار بسیار کمی از mRNA (حدود 5 pg) را در مقایسه با تکنیک سنتی Northern Blot تشخیص دهد.
6. به کمک آن می‌توان ژن‌های جهش یافته و بیان ژن را به راحتی و به سرعت مورد مطالعه قرار داد. این امر امکان تشخیص سرطان در مراحل اولیه، مطالعات جای‌گذاری ژن و نظارت بر نتیجه ژن درمانی را فراهم کرده است.
7. RT-PCR هم یک روش کیفی و هم کمی است. از این رو می‌توان از آن برای شناسایی و همچنین تعیین کمیت RNA نمونه استفاده کرد.

محدودیت‌های RT-PCR

1. فقط می‌تواند RNA ها، به ویژه mRNAها را تکثیر کند.
2. اطلاعات قبلی در مورد توالی RNA برای طراحی پرایمر مورد نیاز است.
3. این یک سیستم مبتنی بر دما و آنزیم کامل است، بنابراین تغییر جزئی در دمای واکنش باعث کاهش کارایی آنزیم می‌شود؛ بنابراین، نیاز به یک سیستم تنظیم دمای دقیق وجود دارد.
4. آلودگی خفیف، در صورت داشتن محل اتصال پرایمر مشابه، می‌تواند تکثیر شود، که این امر منجر به نتیجه مثبت یا منفی کاذب می‌شود.
5. در صورت وجود مقدار کمی از آلاینده‌های آلی یا معدنی در مخلوط واکنش، فرایند واکنش شدیداً تحت تأثیر قرار خواهد گرفت.
6. این فرایند بسیار خسته کننده و پیچیده است و به یک فرد ماهر برای کار نیاز دارد.

همچنین بخوانید:

• PCR-RFLP
• Tetra ARMS PCR
• Real-time PCR در تشخیص بیماری
• Gap-PCR چیست؟ آشنایی کامل با تکنیک Gap-PCR
• Multiplex PCR چیست؟ آشنایی کامل با تکنیک Multiplex PC

منبع

مترجم: مریم محجوب