ترموسایکلر

ترموسایکلر جزء تجهیزات آزمایشگاهی می‌باشد که برای تکثیر شدن DNA با استفاده از روشی به نام اصول PCR می‌باشد . به دلیل مزایای موجود من جمله: سریع بودن جواب آزمایش، قیمت ارزان و کیفیت مناسب، دستگاه آزمایشگاهی پر استفاده ای می‌باشد.

مواد لازم برای استفاده از ترموسایکلر:

DNA الگو (Template) / دزوکسی نوکلئوتیدتری فسفات / پرایمرهای R و ‌F (آغازگرها) / Taq DNA Polymerase / کاتیون‌های دو ظرفیتی نظیر یون دو ظرفیتی منیزیم

 کاربرد دستگاه ترموسایکلر:

برای تشخیص بیماری‌های پیش از تولد / تعیین جنسیت / تشخیص هویت / شناسایی میکروارگانیسم‌هایی که قابل کشت نیستند / تعیین توالی / جداسازی DNA ژنومی دکدینگ و …

انواع برندهای موجود دستگاه ترموسایکلر:

ایرانی

چینی LongGene

آمریکایی و اپندورف آلمان

مراحل کار:

مرحله اول Denaturation (واسرشت): نگهداری محلول مربوطه در دمای °C۹۸ در مدت زمان ۳۰ثانیه    آنزیم هلیکاز مانند یک زیپ ۲ رشته DNA را باز می‌کند و باعث به وجود آمدن تک (DNA مادر) رشته‌های DNA می‌شود.

مرحله دوم Annealing (اتصال): در فاصله زمانی ۴۰-۲۰ ثانیه باید دمای محلول تا °C ۶۰ کاهش یابد دمایی است که پرایمر به توالی مورد نظر اتصال می‌یابد

مرحله آخر Extension (طویل): رسیدن دما به °C ۷۲ و طویل‌تر شدن DNA به میزان ۲ برابر در این دما آنزیم غیر فعال شده و DNA جدید (دختر) تشکیل می‌شود.

نکات: قبل از استفاده از محلول، برای میکس شدن آن باید از ورتکس استفاده نمود پس بعد از ورتکس باید توسط Spiner ،Spin شود تا حجم یکدست شود.

Run کردن نمونه‌های کنترل + و – در ژل الکتروفورز

دستگاه ترموسایکلر گرادیانت (Gradiant PCR):

به علت تشکیل باندهای ثانویه غیر اختصاصی، با تغییرات زیر می توان تجزیه و تحلیل درستی از نتایج PCR داشت.

تیتراسیون غلظت منیزیم / الگو / Primers/ dNT

آنزیم Taq

افزودن دترجنت ها / کاهش سیکل های RR یا افزایش تدریجی درجه حرارت انیل

5 درجه زیر دمای محاسبه شده از نقطه ذوب آغازگر TM آغاز می شود.

تشکیل باندهای غیر اختصاصی ثانویه به دلیل دمای بهینه بسیار بالاتر از دمای محاسبه شده می باشد.

در نتیجه این عوامل، استفاده از عملکرد گرادیانت PCR توصیه می شود این روش باعث تعیین دمای بهینه (تجربی) را با ایجاد شیب دمایی مشخص می نماید.