سایبر گرین

برای بررسی کمی محصولاتی که تولید می شوند از الیگونوکلئوتیدهای اختصاصی توالی استفاده می شود که در هر یک از واکنش PCR می تواند تابش فلورسانس در هر محصول را اندازه گیری کند. در نتیجه این هدف روشی پیشرفته ایجاد گردیده است به نام Real-Time PCR که معنای آن، بررسی هر لحظه و هر مرحله از PCR را گویند.

نام های دیگر این روش، به عنوان PCR کمی یا qPCR  می باشد که می توان برای بررسی کمی توالی های اختصاصی DNA و RNA استفاده نمود. SYBR Green I پرکاربردترین رنگ مخصوص dsDNA در qPCR است و به ssDNA متصل نمی شود. هنگام اتصال، فلورسانس خود را تا 100 برابر افزایش می دهد.  به دلیل نور فلورسانس در این روش از رنگ ها و یا پروب های الیگونوکلئوتیدی فلورسانس می توان استفاده نمود. این دستگاه با توجه به مقدار محصول تولید و یا ایجاد شده نور فلورسانس از خود ساطع می کند که در نتیجه آن نشان دهنده تکثیر DNA می باشد. برای ساطع شدن نور فلورسانس از رنگ سایبر گرین SYBER Green  و یا پروب هایی که بتواند میزان نور را ساطع کند استفاده می شود. هر چقدر ایجاد DNA دو رشته ای بیشتر باشد میزان نور فلورسانس ساطع شده از دستگاه افزایش می یابد. نمودار منحنی ایجاد شده که بر اساس رابطه خطی می باشد، در انتهای هر سیکل ، نشان دهنده غلظت DNA ساخته شده می باشد. رنگ به کار  رفته که معمولا SYBER GREEN می باشد، در رنگ آمیزی اسید نوکلئوییک به کار برده می شود. نوع اتصال آن بدین صورت می باشد که سایبر گرین یک رنگ نامتقارن سیانین است که مستقل از توالی نوکلئوتیدی عمدتاً به شیار کوچک DNA دو رشته ای متصل شده که نشان دهنده میل اتصال زیاد آن به DNA دو رشته ای می باشد تا DNA تک رشته و یا RNA .

ویژگی رنگ سایبرگرین بدین گونه می باشد که جهش زایی کم تر ولی اثر سمی بودن آن به دلیل قدرت نفوذ بالا بیشتر می باشد. می توان syber green را با نور آبی با طول موج 480 نانومتر برانگیخت و طیف تابشی آن با فلورسین با حداکثر 520 نانومتر قابل مقایسه است. فلورسانس رنگ محدود بیش از 1000 برابر بیشتر از رنگ آزاد است و بنابراین، این منجر به افزایش سیگنال فلورسانس می شود،که می تواند در طول مرحله پلیمریزاسیون مشاهده شود و زمانی که DNA دناتوره می شود از بین می رود. در نتیجه، اندازه گیری فلورسانس باید در پایان مرحله، ازدیاد طول هر چرخه PCR را نشان دهد. این روش نیاز به پروب های qPCR را برطرف می کند و استفاده از آن را کم هزینه تر می کند.

نکته :

عیب اصلی syber green این است که ویژگی کاملاً توسط پرایمرها تعیین می شود و بنابراین خطر تقویت محصولات غیر اختصاصی PCR باید در طول بهینه سازی در نظر گرفته شود.