کیت استخراج پروتئین

مقدمه:

این کیت جهت استخراج پروتئین از بافت های جانوری و گیاهی و سلول و نیز باکتری کاربرد دارد. از پروتئین های جدا شده توسط این میتوان جهت بررسی تستهای وسترن بلات و الیزا و اندازه گیری های آنزیمی و فعالیت آنزیمی توسط اسپکتوفتومتر استفاده نمود.

نکته : بعد از اضافه کردن محلول A به لایزیس بافر حداکثر 6 ماه می توان لایزیس را در -20  درجه نگهداری نمود.

نکته: برای تست وسترن بلات با اسکرپر سلول ها را از کف فلاسک جدا نمایید و از آنزیم ترپسین استفاده نکنید.

نکته: نمونه جدا شده با کیت برای انجام تست وسترن بلات بهتر است در 80- نگهداری نمایید.

Protocol

:Cell

500 میکرولیتر لایزیس به حدود 5/0- 3 میلیون سلول شسته شده با PBS در یک میکروتیوپ 5/1 میلی لیتری اضافه کرده ( سلول های را بهتر است با اسکرپر از کف فلاسک سلول جدا نمایید و این کار روی یخ صورت گیرد) و سپس با یک سرنگ 2 میلی لیتری یا سمپلر  یا ورتکس  سلول ها را 5-15 بار و هر بار به مدت 30 ثانیه روی یخ  لیز نمایید. سپس 20 دقیقه سانتریفیوژ با دور 12000rpm در 4 درجه انجام دهید و فاز رویی محلول را برای انجام تست مورد نظر به میکروتیوپ دیگر منتقل کرده.

Tissue:

500میکرولیتر لایزیس به حدود 25 میلی گرم بافت در یک میکروتیوپ 1/5میلی لیتری اضافه کرده و با میکروهموژنایزر یا پنس بافت را روی یخ 5 بار و هر بار به مدت 30 ثانیه لیز نمایید. مواظب باشید که حین لیز کردن گرم شدن هموژنایزر به نمونه آسیب نرساند. سپس 20 دقیقه سانتریفیوژ با دور 12000rpm در 4 درجه انجام دهید و فاز رویی را برای انجام تست مورد نظر به میکروتیوپ دیگر منتقل کرده.

Bacterial: باکتری گرم منفی را قبل از لیز با 20 میکرولیتر لیزوزیم 10 mg/ml در آب استریل به مدت 15-20 دقیقه در دمای 25 درجه روی شیکر تیمار کنید تا دیواره آن از بین برود و این کار برای باکتری گرم مثبت از1-12 ساعت بسته به نوع باکتری متغییر است و باکتری ها را با دور 12000rpm به مدت 5 دقیقه در 4 درجه سانتریفیوژ نمایید و فاز رویی را تخلیه کنید و از رسوب آن جهت استخراج پروتئین استفاده نمایید. پروتئین باکتری را مشابه با روش سلول جداسازی کنید.

نکته : در نهایت غلظت پروتئین را با روش برادفورد بسنجید.