کیت تشخیص پروتئین

دامنه کاربرد

کیت تشخیص پروتئین یک روش رنگ سنجی دقیق برای سنجش کمی پروتئین درمحلول به روش برادفورد است. این کیت برای تعیین غلظت پروتئین در محلول کاربرد دارد.

اساس سنجش پروتئین به روش برادفورد

زمانیکه رنگ کوماسی در محیط اسیدی به پروتئین متصل شود؛ تغییر رنگ از قهوهای (یا قهوهای متمایل به سبز) به آبی رخ می دهد و طول موج بیشینه جذب از  465 نانومتر به 595  نانومتر (در حالت متصل به پروتئین) تغییر می کند. شدت جذب نور در 595  نانومتر با غلظت پروتئین محلول رابطه مستقیم دارد. غلظت پروتئین در نمونه مجهول با استفاده از رسم منحنی استاندارد و معادله منحنی استاندارد و تعیین معادله منحنی، قابل محاسبه است.

 

تهیه رقتهای استاندارد از آلبومین سرم گاوی (BSA):

ابتدا پودر BSA را با آب مقطر یا آب تزریق به حجم یک میلی لیتر برسانید. سپس رقت های زیر را  در میکروتیوپ تهیه کنید. رقت های آماده شده را طبق  پروتکل با معرف برادفورد مخلوط و جذب آن ها را جهت رسم منحنی استاندارد بخوانید.

 

 

سنجش پروتئین در میکروپلیت

1. ابتدا به هر چاهک پلیت 200 میکرولیتر محلول براد فورد اضافه کنید.
2. سپس 5 میکرولیتر از محلول های استاندارد و نمونه مورد سنجش به چاهک ها اضافه کنید.
3. 10 دقبقه انکوباسیون در محیط (ترجیحا تاریک)
4. سپس جذب نمونه ها را در طول موجnm 595 قرائت کنید.

 

سنجش پروتئین در میکروتیوب

1. ابتدا به هر میکروتیوپ 490 میکرولیتر محلول براد فورد اضافه کنید.
2. سپس 10 میکرولیتر از هر یک از محلول های استاندارد و نمونه مورد سنجش به میکروتیوپ ها اضافه کنید.
3. 10 دقبقه انکوباسیون در محیط( ترجیحا تاریک)
4. سپس جذب نمونه ها را در طول موجnm 595 قرائت کنید.

 

رسم منحنی استاندارد:

داده‌ها را در یک صفحه گسترده ثبت کنید و  داده‌های به دست آمده را در مقابل هر غلظت قرار دهید. اگر برای هر غلظت حداقل 3 بار تکرار انجام شده است، می‌توان خطاها را از انحراف استاندارد این اندازه‌گیری‌ها برای تخمین خطای هر نقطه محاسبه کرد. برای بررسی، تمام داده‌ها را با استفاده از نرم افزار  به یک رگرسیون خطی منطبق کنید. خروجی خطی باید یک معادله فرمت y = mx + b باشد، جایی که m شیب است و b  عرض از مبدا نمودار را نشان می‌دهد.

 

 

در این مرحله می‌توان غلظت نمونه مجهول را با استفاده از نمودار خطی محاسبه کرد. اما نکته در اینجاست که منحنی استاندارد به دست آمده، تنها می‌تواند غلظت‌های به دست آمده در محدوده خط را محاسبه کند. اگر جذب نوری به دست آمده و در نتیجه غلظت نمونه بالاتر از محدوده خط باشد، نمونه نیاز به رقیق سازی دارد که میزان این رقیق‌سازی در انتها تاثیر داده می‌شود.