کیت سنجش تکثیر سلول (MTT)

دامنه کاربرد

روش های مختلفی برای سنجش قابلیت حیات سلول وجود دارد که بر اساس انواع عملکردهای سلول مانند فعالیت آنزیمی، نفوذ پذیری غشاء سلولی، تولید  ATP، تولید کوآنزیم و فعالیت جذب نوکلئوتید طراحی شده است. در این میان MTT یکی از پرکاربردترین روشهای رنگ سنجی، بر مبنای فعالیت آنزیمی برای سنجش قابلیت حیات سلولها است و به طور گسترده برای بررسی توان القا یا مهار تکثیر انواع داروها، سایتوکاینها، فاکتورهای رشد، میتوژنها و سایر تیمارها را در in vitro مورد استفاده قرار گرفته است.

اساس سنجش تکثیر سلول به روش MTT

معرف MTT نمک زرد رنگ تترازولیوم با بار مثبت است که از طریق غشای سیتوپلاسمی وارد سلول میشود و توسط  –NAD(P)H اکسید و ردوکتازهای داخل سلولی احیا شده و کریستالهای فورمازان بنفش رنگ تشکیل میدهد. تشکیل کریستالهای بنفش رنگ با فعالیت این آنزیمها رابطه مستقیم دارد که به قابلیت حیات سلول نسبت داده میشود. کریستالهای فرمازان به آسانی در DMSO حل میشود و اندازهگیری جذب در 570 نانومتر میتوان تاثیر تیمار دارویی را بر القا یا مهار رشد سلول محاسبه کرد.

سایر مواد و وسایل مورد نیاز

1- سمپلر و سر سمپلر برای حجمهای 10 تا 1000 میکرولیتر

2- دستگاه میکروپلیت ریدر مجهز به فیلتر 570 نانومتر و پلیت متناسب با دستگاه

 

روش انجام آزمایش

1- سلولها را بسته به اندازهای که دارند، به تعداد 5 × 10² – 1 × 10⁵ سلول در هر 100 میلیلیتر، در هر چاهک پلیت 96 خانه مخصوص کشت سلول

بریزید . پلیت را در انکوباتور ) CO2 ٪ (5 با دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 72ساعت نگهداری کنید ) .این زمان می تواند بسته به نوع بررسی شما و قدرت تکثیر سلول کاهش یا افزایش یابد(.

– بهتر است علاوه بر سلولهای تحت تیمار، سلولهای تیمار نشده و چاهک فاقد سلول هم به عنوان کنترل داشته باشید.

2- برای آماده کردن معرف، ویال حاوی محلول MTT را از فریزر خارج کنید و در تاریکی در دمای اتاق قرار دهید تا ذوب شود. سپس به آرامی تکان دهید تا محلول یکنواخت شود.

– توجه کنید که هر ویال از MTT برای 100 تست معادل یک پلیت 96  خانه در نظر گرفته شده است.

3- با استفاده از سمپلر، 10 میکرولیتر از محلول MTT را به هر چاهک اضافه کنید و با دست یا روی شیکر به آرامی حرکت دهید تا یکنواخت شود.

-توجه کنید که هر 10 میکرولیتر MTT باید به 100 میکرولیتر مایع رویی کشت سلول اضافه شود. چنانچه از حجمهای بیشتر یا ظروف کشت بزرگتر از پلیت 96 خانه استفاده میکنید باید حجم متناسب با حجم مایع رویی کشت سلول اضافه کنید.

4- پلیت را ۴ تا 6 ساعت در انکوباتور ) CO2 ٪ (5 با دمای 37 درجه سانتیگراد قرار دهید.

5- در سلولهای چسبیده مایع رویی سلولها را کاملا و به آرامی بکشید. به گونهای که سلولها از ته پلیت کنده نشود. در مورد سلولهای معلق، میتوانید پلیت را به مدت 10 دقیقه و در 400g سانتریفیوژ کنید یا صبر کنید سلولها خوب ته نشین شود و سپس مایع رویی را به آرامی بردارید.

6 – به هر چاهک 100 میکرولیتر DMSO اضافه کنید و صبر کنید تا کریستالهای فورمازان حل شود و محلول صورتی-بنفش به وجود آید. چنانچه کریستالها زیاد بود برای یکنواخت شدن رنگ و حل شدن کامل کریستالها میتوانید از پیپت کردن کمک بگیرید.

-توجه داشته باشید که پس از حل شدن باید بلافاصله جذب را بخوانید. در غیر این صورت در حضور نور، رنگ محلول تغییر خواهد کرد.

7- با استفاده از میکروپلیت ریدر، جذب نمونه ها را در 570 نانومتر بخوانید.

 

نگهداری

لطفا پس از دریافت مواد را خارج کرده و با توجه به اطلاعات مندرج در روی لیبل و جدول، در شرایط بهینه نگهداری نمایید.