کیت سنتز cDNA

راهنمای خرید کیت سنتز cDNA:

DNA مکمل (cDNA) یک کپی DNA از یک مولکول RNA پیام رسان (mRNA) است که توسط رونوشت معکوس، یک DNA پلیمراز تولید می شود که می تواند از DNA یا RNA به عنوان الگو استفاده کند.

واکنش های رونویسی معکوس شامل سه مرحله اصلی است:

1. پرایمر آنلینگ
2. پلیمریزاسیون DNA
3.  غیرفعال کردن آنزیم

دما و مدت این مراحل بر اساس انتخاب پرایمر، RNA هدف و ترانس کریپتاز معکوس مورد استفاده متفاوت است. مرحله مهم در طی پلیمریزاسیون DNA است. برای انتخاب کیت سنتز cDNA، آنزیم ترانس کریپتاز معکوس و پرایمینگ مورد استفاده برای شروع واکنش بسیار مهم است. انتخاب آنزیم بر سرعت سنتز و صحت واکنش تأثیر می گذارد.

PCR رونویسی معکوس کمی (RT-qPCR) زمانی استفاده می شود که ماده اولیه RNA باشد. در این روش، RNA ابتدا توسط رونویسی معکوس از RNA کل یا RNA پیام رسان (mRNA) به DNA مکمل (cDNA) رونویسی می شود. سپس از cDNA به عنوان الگوی واکنش qPCR استفاده می شود.

در زیست شناسی مولکولی، DNA مکمل (cDNA) از یک الگوی RNA در واکنشی که توسط آنزیم ترانس کریپتاز معکوس (RTase) کاتالیز می شود، سنتز می شود. سنتز cDNA اولین مرحله در بسیاری ازمطالعات زیست‌شناسی مولکولی است، مانند مطالعات بیان ژن با استفاده ازreal-time PCR.

سنتز رشته اول cDNA از اولیگو(dT)، آغازگرهای تصادفی یا ترکیبی از این استراتژی ها برای آغاز واکنش رونویسی معکوس استفاده می کند. پرایمینگ یک واکنش با الیگو(dT) سنتز را ترجیحاً در انتهای ‘3 قطعه RNA آغاز می کند.

اگر از RNA خالص شده به عنوان الگوی سنتز cDNA استفاده می شود، حداکثر 2.5 میکروگرم RNA/20 میکرولیتر واکنش استفاده کنید. اگر بیش از 1 میکروگرم RNA به ازای هر 20 میکرولیتر واکنش سنتز cDNA استفاده شد، در واکنش PCR بعدی از cDNA بیشتر از 25 درصد استفاده نکنید.

غلظت پرایمرها بسته به بهترین شرایط ممکن است بین 100 نانومولار تا 500 نانومتر متغیر باشد. به عنوان مثال، آنزیم MMLV رونوشت معکوس با پردازش کم اغلب به بیش از 60 دقیقه برای سنتز cDNA نیاز دارد. در مقابل، یک ترانس کریپتاز معکوس مهندسی شده با فرآیند بالا ممکن است 10 دقیقه طول بکشد تا یک cDNA 9 کیلوبایتی را سنتز کند.

کیت سنتز cDNA را می توان در 6 مرحله مهم و اصلی معرفی نمود:

• آنزیم MMLV
• x first- strand buffer 5
• Oligo(dt) 18 primer
• Random Hexamer primer
• RNasein
• dNTP

تفاوت اصلی cDNA با DNA در اینترون می باشد بدین معنی که cDNA فاقد اینترون می باشد در نتیجه DNA ژنومی کوتاه تر بوده و بررسی مطالعات با سرعت ، دقت و کیفیت بالاتری انجام می شود. در واقع سنتز cDNA یک رونویسی معکوس می باشد که با استفاده از کیت سنتز cDNA و داشتن محتوا رونویسی معکوس را انجام می دهد.

کاربرد cDNA در تحقیقات زیستی متفاوت از جمله برای کلون کردن ژن و یا به عنوان پروب در آنالیز ژنها کاربرد دارد. مهم ترین استفاده آن برای بررسی سطح بیان ژن می شود.سنتز cDNA از  5^/ به  3^/ انجام می شود. یک توالی بسیار بلند و طولانی از نوکلئوتید های آدنین که به اسم دم پلی A شناخته می شوند به عنوان محلی برای شروع رونویسی معکوس استفاده می شوند.

cDNA روش راحت‌تری برای کار با توالی کدکننده نسبت به mRNA است، زیرا RNA به راحتی توسط RNaseهای موجود در همه جا تجزیه می‌شود. این دلیل اصلی تعیین توالی cDNA به جای mRNA است. به همین ترتیب، محققین، اغلب mRNA را به cDNA تبدیل می‌کنند تا پروب‌های خود را تولید کنند.

• اگر نمونه باید برای مدت طولانی تری ذخیره شود، 0.5 میکرولیتر از بافر 10X NEBNext Cell Lysis را به cDNA اضافه کنید (بعد از RT به جای مرحله PCR). سپس نمونه ها را می توان تا 7 روز در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری کرد، اما ممکن است کاهش جزئی در عملکرد مشاهده شود.

مشاهده لیست کامل کیت‌ها