sgRNA: نحوه طراحی، کلونینگ و دلیوری

نحوه طراحی، کلونینگ و دلیوری sgRNA

ما در حال حاضر در حال تجربه یک انقلاب بیوتکنولوژی هستیم. پیشرفت در ژنومیک، که توسط فناوری CRISPR-Cas9 رهبری می شود، تحقیقات مهندسی ژنوم را بسیار تسریع کرده است. از آنجایی که CRISPR هر روز درها را برای تعداد فزاینده ای از برنامه ها باز می کند، محققان بیشتری از این تکنیک برای مطالعات خود استفاده می کنند.

مقدمه ای بر فناوری CRISPR-Cas9

قبل از اینکه به عمق بحث خود در مورد RNA های راهنمای منفرد یا sgRNA بپردازیم، اجازه دهید ابتدا مکانیسم ویرایش ژن CRISPR-Cas9 را مرور کنیم. محبوبیت CRISPR تا حد زیادی به دلیل سادگی آن است. همانطور که در شکل نیز نشان داده شده است، سیستم CRISPR-Cas بر دو جزء اصلی متکی است: یک RNA راهنما (sgRNA) و یک نوکلئاز مرتبط با CRISPR به نام Cas.

RNA راهنما یک توالی RNA خاص است که ناحیه DNA هدف مورد نظر را تشخیص می دهد و هسته Cas را برای ویرایش به آنجا هدایت می کند. sgRNA از دو بخش تشکیل شده است: crispr RNA (crRNA) که یک توالی 20 -17 نوکلئوتیدی مکمل DNA هدف است و یک tracr RNA که به عنوان داربست اتصالی برای نوکلئاز Cas عمل می کند.

پروتئین مرتبط با CRISPR یک اندونوکلئاز غیر اختصاصی است. توسط یک sgRNA به مکان خاص DNA هدایت می شود، جایی که باعث شکستن دو رشته ای می شود. انواع مختلفی از نوکلئازهای Cas جدا شده از باکتری های مختلف وجود دارد. متداول ترین مورد استفاده، نوکلئاز Cas9 از استرپتوکوک پیوژنز است.

شکل بالا سیستم CRISPR-Cas9 را نشان می دهد که شامل یک RNA راهنما (sgRNA) و نوکلئاز Cas9 است که با هم یک کمپلکس ریبونوکلئوپروتئین (RNP) را تشکیل می دهند.

وجود یک موتیف خاص با نام PAM در DNA ژنومی برای اتصال sgRNA به توالی هدف مورد نیاز است. سپس هسته Cas9 یک شکاف دو رشته ای در DNA ایجاد می کند (که با قیچی مشخص می شود). مکانیسم‌های ترمیم درون‌زا که توسط شکست دو رشته‌ای ایجاد می‌شوند، ممکن است منجر به حذف ژن از طریق یک جهش تغییر چهارچوب یا ضربه به یک توالی مورد نظر در صورت وجود الگوی DNA شود.

تفاوت بین gRNA و sgRNA چیست؟

بخش crRNA از gRNA جزء قابل تنظیم است که ویژگی را در هر آزمایش CRISPR امکان پذیر می کند. اما ممکن است اصطلاح دیگری به نام sgRNA را که معمولا در منابع مرتبط با CRISPR استفاده می شود، شنیده باشید. بنابراین دقیقا تفاوت بین gRNA و sgRNA چیست؟

sgRNA مخفف RNA راهنمای منفرد است. همانطور که از نام آن پیداست، sgRNA یک مولکول RNA منفرد است که شامل هر دو توالی crRNA کوتاه طراحی شده است که به توالی tracrRNA ادغام شده است. sgRNA را هم می توان به صورت مصنوعی و هم به صورت invivo و invitro از یک الگوی DNA تولید کرد.

در حالی که crRNA ها و tracrRNA ها به عنوان دو مولکول RNA مجزا در طبیعت وجود دارند، sgRNA ها به محبوب ترین فرمت برای RNA های راهنمای CRISPR نزد محققان تبدیل شده اند، بنابراین اصطلاحات sgRNA و gRNA این روزها اغلب با همان معنی در جامعه CRISPR استفاده می شوند. با این حال، برخی از محققان هنوز از RNA های راهنما با اجزای crRNA و tracrRNA جدا استفاده می کنند که معمولا به عنوان gRNA های 2 تکه با نام CRISPR tracer RNA ها نامیده می شوند.

اصطلاح sgRNA قبلا در جاهای دیگر برای اشاره به انواع مختلف RNA های CRISPR از جمله RNA راهنمای مصنوعی و RNA راهنمای کوتاه استفاده شده است. در این راهنما، ما از تعاریف مرسوم برای جلوگیری از سردرگمی استفاده کرده‌ایم. gRNA اصطلاحی است که تمام قالب های RNA راهنمای CRISPR را توصیف می کند و sgRNA به جایگزین ساده تری اشاره دارد که هر دو عنصر crRNA و tracrRNA را در یک مولکول RNA واحد ترکیب می کند.

طراحی sgRNA برای آزمایشات CRISPR

توالی RNA راهنمای CRISPR مستقیما بر کارایی برش DNA هدف و اتصال و برش غیرعمدی خارج از هدف تأثیر می گذارد. بنابراین، طراحی RNA راهنمای مناسب یک گام حیاتی برای موفقیت آزمایش های CRISPR شما است و چندین پارامتر مهم وجود دارد که باید در هنگام طراحی یک RNA راهنما در نظر بگیرید.

نوکلئاز Cas شما از چه توالی PAM استفاده می کند؟

هر نوکلئاز Cas فقط در حضور یک توالی خاص، به نام موتیف PAM، روی رشته DNA غیر هدفمند به توالی هدف خود متصل می شود. بنابراین، مکان‌هایی در ژنوم که می‌توانند توسط پروتئین‌های مختلف Cas مورد هدف قرار گیرند، توسط مکان‌های این توالی‌های PAM محدود می‌شوند. نوکلئاز 4-3 نوکلئوتید را در بالادست توالی PAM برش می دهد.

نوکلئازهای Cas جدا شده از گونه های مختلف باکتری توالی های مختلف PAM را تشخیص می دهند. توجه داشته باشید که اگرچه خود توالی PAM برای برش ضروری است، اما نباید در توالی RNA راهنمای منفرد گنجانده شود.

استفاده از نرم افزار برای طراحی sgRNA های CRISPR

هنگامی که ژن هدف و نوکلئاز Cas انتخاب شد، گام اساسی بعدی طراحی توالی RNA راهنمای خاص است. چندین ابزار نرم افزاری برای طراحی یک راهنمای بهینه با حداقل اثرات خارج از هدف و حداکثر بازده هدف وجود دارد. ابزارهای زیر محبوب ترین ابزارهای راهنمای طراحی RNA موجود هستند که دارای رابط کاربری گرافیکی برای سهولت استفاده هستند که عبارتند از:

• ابزار طراحی Synthego
• طرح sgRNA متعلق به Broad Institute
• ابزار CRISPOR
• ابزار CHOPCHOP
• ابزار Off-Spotter
• ابزار Cas-OFFinder
• ابزار CRISPR-Era

تعدادی از این ابزارها، مانند Off-Spotter و Cas-Offinder، به طور خاص برای تشخیص ویرایش بالقوه خارج از هدف توسعه یافته اند. سایرین، مانند CHOPCHOP، نه تنها برای Cas9 هستند، بلکه گزینه‌هایی برای هسته‌های Cas جایگزین و شناسایی PAM نیز ارائه می‌دهند.

ابزار طراحی Synthego طراحی سریع و آسان sgRNA ها را ارائه می دهد که تا 97 درصد راندمان ویرایش و کمترین اثرات خارج از هدف را از کتابخانه ای با بیش از 120000 ژنوم و بیش از 8300 گونه ایجاد می کند. این ابزار همچنین می تواند برای اعتبارسنجی راهنماهای طراحی شده با استفاده از روش های دیگر استفاده شود.

ابزار طراحی Synthego بسیار سریع و از نظر بصری جذاب است.

ملاحظات مهم و عوامل محدود کننده برای طراحی sgRNA

هنگام طراحی sgRNA برای آزمایشات CRISPR چندین چیز وجود دارد که باید در نظر بگیرید:

1. محتوای GC، sgRNA مهم است، زیرا محتوای GC بالاتر آن را پایدارتر می کند. محتوای GC بایستی بین 40-80 درصد باشد.
2. طول sgRNA بسته به نوکلئاز Cas خاصی که استفاده می کنید، بایستی بین 24-17 نوکلئوتید باشد.
3. عدم تطابق بین gRNA و محل هدف بسته به تعداد عدم تطابق و موقیت های آنها می تواند منجر به اثرات خارج از هدف شود.
4. ممکن است نیاز به طراحی sgRNA های متعدد برای هر ژن مورد نظر باشد، زیرا فعالیت و ویژگی می تواند غیرقابل پیش بینی باشد.

صفحات مرتبط:

• دوره مهارت آموزی ژن درمانی
• کارآموزی مهندسی ژنتیک و کلونینگ