اطلاعات عمومی
Taq polymerase چیست؟ کاربردهای تگ پلیمراز
Taq polymerase چیست؟
Taq DNA Polymerase یا Taq polymerase یک کاتالیزور بیولوژیکی است که در اتصال نوکلئوتیدها به سنتز DNA، مانند هر پلیمراز دیگری نقش دارد.
Taq polymerase یک همولوگ از آنزیم DNA پلیمراز 1 ( Pol 1) موجود در اشریشیا کُلی (Escherichia coli (E.coli)) میباشد که یک پروتئین اسید آمینه 832 با وزن مولکولی تقریبی 94 کیلو دالتون است.
اما چیزی که در مورد این پلیمراز عجیب است این است که بر خلاف بسیاری از آنزیم‌های شناخته شده که فقط در دمای 37 درجه سانتی گراد (دمای بدن) به درستی کار میکنند، آنزیمی مقاوم در برابر حرارت است که میتواند در شرایط دمای بالا مقاومت کند.
دمای بهینه برای اینکه تگ پلیمراز در فعال‌ترین حالت خود باشد، 70 تا 75 درجه سانتیگراد است و حتی در دمای 92 درجه سانتیگراد نیز پایداری حرارتی را نشان می‌دهد.
این آنزیم چگونه و از کجا پیدا شد؟
در دهه 1960 بود که Thomas D. Brook آزمایشی را انجام داد که در آن از باکتری‌های موجود در دریاچه‌ها و چشمه‌های پارک ملی Yellowstone نمونه‌برداری میکرد.
او رشته‌هایی از باکتری‌ها را کشف کرد که در یک چشمه آب گرم با دمای بالای ۸۰ درجه رشد میکنند. این اولین گونه باکتریایی بود که در برابر چنین شرایط دمایی شدید مقاومت میکرد.
او این باکتری‌ها را Thermus aquaticus نامید که با علامت اختصاری «Taq» نشان داده میشود. لفظ Thermus را به دلیل “پایداری در دمای بالا” و aquaticus را به دلیل اینکه در “آب‌های گرم” یافت می‌شدند، برای نامگذاری انتخاب کرد.
بعداً در سال 1976، Chien و همکارانش یک مولکول پروتئینی از این باکتری پایدار در برابر حرارت به نام Taq polymerase (به طور خاص Taq DNA Polymerase) را جدا کرند.
این پلیمراز میتواند دماهای بسیار بالا را تحمل کند و مزیتی برای زیست شناسان جهت انجام همانندسازی DNA در شرایط گرم ایجاد میکند.
رایج‌ترین کاربرد تگ پلیمراز استفاده از آن در انجام واکنش زنجیرهای پلیمراز (Polymerase Chain Reaction (PCR)) است که در ادامه به آن پرداخته خواهد شد.
واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR) چیست؟
واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR) یک تکنیک زیستشناسی مولکولی شناخته شده است که برای کپی کردن قسمت‌های خاصی از DNA استفاده میشود.
همانطور که یک دستگاه فتوکپی میتواند صفحات یک کتاب را کپی کند، PCR نیز تولید میلیاردها نسخه از یک بخش DNA را تسهیل میکند.
Kary Mullis این تکنیک فتوکپی DNA را اختراع کرد و با این کار تحقیقات در زمینه زیستشناسی مولکولی را متحول کرد. تکثیر DNA در شرایط آزمایشگاهی امکانپذیر شد و محققان اکنون میتوانند تنها در چند چرخه واکنش، کپی‌های جدیدی از الگوهای DNA متفاوت بسازند.
PCR در زیست شناسی مولکولی، بیوتکنولوژی، مطالعات ژنومی و توالی‌یابی ژنوم، تحقیقات زیست‌پزشکی و تشخیص پزشکی کاربرد دارد.
انواع مختلفی از تکنیک‌های PCR بر این اساس که کدام اسید نوکلئیک (RNA یا DNA) باید تحت تکثیر PCR قرار گیرد، وجود دارند. Real-Time PCR رایج ترین روش PCR است که به آن quantitative PCR (qPCR) نیز می‌گویند.
PCR چگونه کار میکند؟
برای انجام تکثیر آزمایشگاهی DNA با استفاده از PCR، یک دستگاه PCR (ترموسایکلر (Thermocycler)) به همراه چندین جزء اصلی مورد نیاز است. این ترکیبات اصلی یا شناساگرهای PCR عبارتند از:
- DNA الگو: بخشی از DNA که باید کپی شود.
- بافر PCR: جهت اطمینان از شرایط بهینه برای واکنش است که از Tris-HCl، کلرید پتاسیم (KCl) و کلرید منیزیم (MgCl2) تشکیل شده است.
- نوکلئوتیدهای DNA (dNTPs): برای ساختن رشته DNA جدید مورد نیاز است.
- پرایمرهای PCR: رشته‌های کوتاهی از DNA (الیگونوکلئوتیدها (Oligonucleotides)) که PCR با آنها آغاز میشود.
- DNA پلیمراز مقاوم در برابر حرارت (Taq polymerase): برای طویل شدن DNA در امتداد رشته الگو.
سپس این اجزا به صورت متوالی در یک لوله PCR استریل قرار میگیرند و واکنش PCR آغاز میشود.
PCR یک فناوری وابسته به دما است که شامل سه مرحله برای تکمیل یک چرخه از واکنش است:
- دناتوراسیون یا Denaturation (94 درجه سانتیگراد)
DNA الگو طوری گرم میشود که دو رشته مکمل از هم جدا شوند.
- اتصال یا Annealing (55-65 درجه سانتیگراد)
دما کاهش مییابد تا امکان اتصال DNA پلیمراز و پرایمر به DNA الگو که حالا تک‌رشته‌ای است، فراهم شود و به عنوان نقطه شروع سنتز DNA عمل کنند.
- طویل شدن یا Extension (72 درجه سانتیگراد)
این مرحله نهایی جایی است که Taq polymerase وارد عمل میشود. هنگامی که پرایمرها متصل شدند، Taq polymerase جای آنها روی رشته را میگیرد تا با افزودن dNTPs رشته‌های جدیدی تولید کند. این امر منجر به تولید رشته‌های DNA مکمل (complementary DNA (cDNA)) جدید میشود.
بنابراین رشته‌های تازه سنتز شده به عنوان الگو در چرخه بعدی PCR عمل میکنند. پس از هر چرخه، DNA دو برابر میشود. این چرخه حدود 25 تا 35 بار تکرار میشود و تقریباً 2 تا 4 ساعت طول میکشد تا کل روند کامل شود و محصول PCR به دست آید.
مرحله بعدی انجام الکتروفورز ژل آگارز (Agarose gel electrophoresis) و به دست آوردن میلیاردها نسخه از DNA است!
Taq Polymerase در PCR چه کاری انجام می‌دهد؟
Taq DNA polymerase ستون فقرات PCR است. بدون Taq polymerase، PCR نیز وجود نخواهد داشت.
تکثیر به روش PCR بر اساس اصل تغییرات دما (واکنش‌ها نسبت به گرما و سرما) عمل میکند که Taq polymerase را به آنزیمی بسیار سودمند تبدیل میکند. دلیل اصلی این امر این است که Taq polymerase میتواند در دماهای بالا با راندمان و ظرفیت تکثیر بالا کار کند، که دیگر آنزیم‌های بدن نمیتوانند این کار را انجام دهند. تگ پلیمراز میتواند 150 نوکلئوتید در ثانیه اضافه و 1000 رشته جفت باز DNA را در کمتر از 10 ثانیه در دمای 72 درجه سانتیگراد تکثیر کند.
مرحله طویل شدن PCR در جایی اتفاق میافتد که Taq DNA polymerase به کار گرفته میشود و به محل اتصال پرایمر و DNA الگو میچسبد و از آن به عنوان یک بستر استفاده میکند. توالی DNA را میخواند و شروع به اضافه کردن نوکلئوتیدها (dNTPs) در جهت کربن ′5 نوکلئوتید به کربن ′3 نوکلئوتید میکند.
Taq polymerase در دمای 72 درجه سانتیگراد به طور بهینه فعال است، به همین دلیل است که مرحله طویل شدن دقیقا در این دمای انجام میشود.
علاوه بر این، برای عملکرد بهتر Taq polymerase، یون منیزیم (Mg2+) به شکل MgCl2 به بافر PCR اضافه میشود. Mg2+ کوفاکتوری (Cofactor) است که به قسمت فعال Taq polymerase متصل میشود و شکل‌گیری پیوندهای فسفودیاستر (Phosphodiester bond) را به منظور ترکیب نوکلئوتیدهای DNA جدید، تسریع میکند و آن را به یک نیاز الزامی تبدیل میکند.
آزمایش استاندارد PCR زمانی موفقیت آمیز است که وقتی Mg2+ در بافر وجود دارد، Taq polymerase اضافه شود.
مزایا و معایب Taq Polymerase
اگرچه کشف تگ پلیمراز یک مزیت بزرگ برای تحقیقات علمی بوده است، اما معایبی نیز دارد.
| مزایا | معایب |
| پایداری حرارتی: Taq polymerase میتواند در دماهای بالا مقاومت کند که به کارگیری آن در انجام PCR را ممکن میسازد.
کارایی: در شرایط دمایی بهینه، این پلیمراز به طور موثری از نوکلئوتیدها برای سنتز یک رشته DNA جدید به شکل مکمل استفاده میکند.
ظرفیت تکثیر بالا: در طول فرایند تکثیر، Taq polymerase ظرفیت اضافه کردن 150 نوکلئوتید در ثانیه را دارد. نیمه عمر در دمای 92 درجه سانتی گراد: نیمه عمر آن بیش از 2 ساعت است که بیشتر از هر پلیمراز دیگری است. این امر Taq Polymerase را به ابزاری قدرتمند برای تکثیر آزمایشگاهی DNA هدف تبدیل میکند. |
دقت کم (Low Fidelity): یک DNA polymerase معمولی عمدتاً دو نقش دارد: فعالیت اگزونوکلئازی (Exonuclease) در جهت کربن ′5 نوکلئوتید به کربن ′3 نوکلئوتید و فعالیت تصحیح اگزونوکلئازی در جهت کربن ′3 نوکلئوتید به کربن ′5 نوکلئوتید. Taq DNA polymerase فاقد قدرت تصحیح است و نمیتواند نوکلئوتیدهای نامنطبق را شناسایی و تصحیح کند. به همین دلیل دستیابی به یک رشته DNA بدون خطا را دشوار میکند.
اختصاصیت کم (Low Specificity): از آنجایی که Taq polymerase آنزیمی وابسته به دما است، تغییر جزئی دما میتواند بر فعالیت پلیمراز تأثیر بگذارد. این امر میتواند منجر به تغییر در پیکربندی آنزیم و حتی عدم تطابق نوکلئوتیدها شود و پلیمراز را کمتر اختصاصی کند. تحقیقات نشان داده است که به ازای هر 9000 نوکلئوتید، یک نوکلئوتید اشتباه اضافه میشود. فعالیت یک سویه (Unidirectional activity): برخلاف سایر پلیمرازها، Taq polymerase فقط در جهت 5’ به 3’ عمل میکند و ترمیم برش را در جهت 3’ به 5’ انجام نمیدهد. از این رو حرکت آن یک سویه است. نیاز به کاتیون دو ظرفیتی (Bivalent Cation Requirement): یک کوفاکتور اضافی برای عملکرد موثر Taq polymerase (یون فلزی Mg2+) مورد نیاز است. بدون این کاتیون دو ظرفیتی، Taq polymerase چندان کاربردی نخواهد داشت. |
به طور خلاصه، Taq Polymerase دارای پایداری حرارتی و فرآیندپذیری بالا اما دقت و ویژگی کم میباشد. خوشبختانه، پیشرفت در فناوری DNA نوترکیب، غلبه بر معایب فوق را ممکن ساخته است. Taq Polymeraseهایی وجود دارند که اکنون به صورت تجاری در دسترس هستند که دارای ویژگی بالا، دقت بالا و حساسیت بالا هستند و میتوانند بر اساس نوع PCR اصلاح شوند.
به علاوه همانطور که در Hot Start PCR مشاهده میشود، اصلاحات PCR معمولی مسیر دقت و ویژگی تکثیر DNA را تغییر داده و در نتیجه اتصال غیر اختصاصی را کاهش داده است.
بیشتر مطالعه کنید:
مترجم: فاطمه فریادرس
