تکنیک استخراج DNA و 4 مرحله اصلی آن

• تهیه عصاره سلولی

برای استخراج DNA از بافت یا سلولهای مورد نظر، سلولها باید جدا شده و غشاهای سلولی از بین روند. “بافر استخراج” در انجام این فرآیندها کمک می کند. مواد شیمیایی مانند EDTA (اتیلن دی آمین تترا استات) یون های Mg2 را که برای حفظ ساختار کلی غشای سلولی ضروری هستند، از بین برده و SDS (سدیم ددسیل سولفات) با از بین بردن چربی های غشای سلول، به این فرایند کمک می کند. بقایای سلولی و اندامکهای جزئی هضم شده و غیره را می توان با سانتریفیوژ ته نشین کرده و عصاره سلول را به عنوان یک ماده رویی استفاده کرد.

• خالص سازی DNA از عصاره سلولی

علاوه بر DNA، عصاره سلول حاوی مقادیر قابل توجهی پروتئین و RNA است. برای از بین بردن این آلودگی ها می توان از روشهای مختلفی استفاده کرد و DNA را به شکلی خالص جدا کرد. روش استاندارد برای جدا کردن عصاره سلولی اضافه کردن فنل یا مخلوط 1: 1 فنل-کلروفرم است. این حلال های آلی پروتئین ها را رسوب می دهند اما اسیدهای نوکلئیک را در محلول های آبی رها می کنند. راه مؤثر برای از بین بردن RNA با استفاده از آنزیم ریبونوکلئاز است که به سرعت این مولکول ها را در زیر واحد های ریبونوکلئوتید تخریب می کند.

• تغلیظ نمونه های DNA

متداول ترین روش تغلیظ، استفاده از میزان متفاوت اتانول است. در حضور نمک و در دمای 20- درجه سانتیگراد یا کمتر، اتانول مطلق اسیدهای نوکلئیک پلیمری را به طور موثری رسوب می دهد. با استفاده از محلول غلیظ DNA می توان از میله شیشه ای برای بیرون کشیدن رشته های چسبنده DNA استفاده کرد در حالی که برای محلول های رقیق DNA رسوب شده می توان از سانتریفیوژ و شست شو با آب استفاده کرد.

• اندازه گیری خلوص و غلظت DNA

غلظت DNA را می توان با طیف سنجی جذب UV با دقت اندازه گیری کرد. میزان تابش اشعه ماوراء بنفش جذب شده توسط محلول DNA مستقیماً با مقدار نمونه DNA متناسب است. معمولاً میزان جذب در 260 نانومتر اندازه گیری می شود که در آن طول موج جذب 1.0 تا 50 میکروگرم DNA دو رشته در میلی لیتر مطابقت دارد. از جذب اشعه ماوراء بنفش نیز می توان برای بررسی خلوص یک آماده سازی DNA استفاده کرد.

پروتکل تکنیک استخراج DNA :

1. در یک لوله استریل Eppendorf 1.5 میلی لیتر استریل، 180 میکرولیتر از محلول Lysis S (برای بافت) و 20 میکرولیتر از محلول پروتئیناز K را اضافه کنید. بر روی یخ نگه دارید.
2. از حدود 50 میلی گرم ماهیچه قلب در طی فرآیند همگن سازی و انتقال، 50 درصد از دست می رود. نمونه را با نیتروژن مایع فریز کنید. نگذارید نیتروژن مایع کاملاً تبخیر شود تا اینکه همگن شدن کامل شود. بیش از حد نیتروژن مایع موجود در محیط باعث می شود که به سختی بتوانید بافت را خرد کنید، زیرا هنگام تلاش برای خرد کردن قسمت های بیشتری از ماهیچه شکسته می شود. بافت را آنقدر خرد کنید تا یک پودر خوب بدست آید.
3. از یک اسپاتول کوچک استفاده کنید و به سرعت بافت منجمد و پودری شده را درون لوله از پیش آماده شده حاوی Lysis Solution T / Proteinase K با دمای 55 درجه سانتیگراد بریزید تا بافت کاملاً هضم شود (حداقل 2 ساعت، حداکثر 4 ساعت).
4. بعد از دوره انکوباسیون، محلول را تا دمای اتاق سرد کنید. 20 میکرولیتر از RNase  را اضافه کنید و بگذارید 2 دقیقه دیگر در دمای اتاق انکوبه شود.
5. 5.     200 میکرولیتر از محلول Lysis  (برای لیز کردن سلول ها) به نمونه اضافه کرده و به مدت 15 ثانیه مخلوط کنید. نمونه را تا 70 درجه سانتیگراد گرم کرده و پس از 10 دقیقه مرحله 6 را ادامه دهید.
6. از ستون فیلتر دار استفاده کرده و نمونه مورد نظر را بر روی آن اضافه می کنیم. 200میکرولیتر اتانول به نمونه اضافه کرده و به مدت 5-10 ثانیه مخلوط کنید تا محلول یکدست شود. روش دیگر پیپتاژ است.
7. سانتریفیوژ به مدت 1 دقیقه و 13000 دور در دقیقه.
8. مایع رویی را دور ریخته و ستون را در یک لوله 2 میلی لیتر جدید قرار دهید. 500 میکرولیتر محلول شستشو را به پلت اضافه کرده و سانتریفیوژ مجدداً به مدت 1 دقیقه انجام دهید.
9. مایع رویی را دور بریزید و سپس 100 میکرولیتر از محلول شستشوی (بافر Tris-EDTA ، pH 9.0) را مستقیماً درون مرکز ستون اتصال بپیچید و بگذارید حدود 5 دقیقه در دمای اتاق بنشیند. 1 دقیقه سانتریفیوژ کنید. ستون را دور بریزید. محلول باقی مانده حاوی DNA است.
10. جذب نمونه DNA ژنومی خود را در 260 و 280 نانومتر انجام دهید و غلظت آن را محاسبه کنید.

برای مطالعه سایر تکنیک آزمایشگاهی کلیک کنید.

برای سفارش خدمات به آزمایشگاه ژنتیک مولکولی ژنیران اینجا کلیک کنید

برای مشاهده و ثبت نام در دوره آموزشی ژنتیک مولکولی اینجا کلیک کنید