رنگ آمیزی اورامین-رودامین: کاربرد، روش کار و تفسیر نتایج

فهرست مطالب نمایش

رنگ آمیزی اورامین-رودامین چیست؟

تکامل در روش‌های رنگ آمیزی به عصری از تکنیک‌های رنگ آمیزی اصلاح‌شده منجر شد که در تفسیر نتایج سریع‌تر، چندکاربردی‌تر و قابل اعتمادتر هستند. رنگ آمیزی اورامین-رودامین یکی از آن تکنیک‌ها است که با اصلاح روش رنگ آمیزی اسید فست (Acid Fast) (که با نام رنگ آمیزی Ziehl-Neelsen شناخته می‌شود و برای رنگ آمیزی باکتری‌های گونه مایکوباکتریوم به کار می‌رود) به دست آمده است. تفاوت عمده این دو روش در نوع شناساگرهای مورد استفاده برای رنگ آمیزی و نحوه مشاهده آن‌ها است.
تکنیک رنگ آمیزی اورامین-رودامین که یک نوع بافت‌شناسی رنگ است، برای رنگ آمیزی و نشان دادن حضور باسیل‌های اسید فست در زیر میکروسکوپ فلورسنت استفاده می‌شود و همچنین به عنوان رنگ آمیزی ترانت اورامین-رودامین (Truant auramine–rhodamine stain) شناخته می‌شود که آناتومی سلول باسیل باکتریایی را نشان می‌دهد.
دیواره سلولی باکتری گونه‌های مایکوباکتریوم از اسید مایکولیک (Mycolic acid) تشکیل شده است (مایکولیک اسیدها، اسیدهای چرب و بلندی هستند که در دیواره سلولی گونه‌های مایکوباکتریوم یافت می‌شوند و اجزای اصلی و اختصاصی لیپیدی مربوط به پوشش سلولی مایکوباکتری هستند و برای بقای آن‌ها ضروری هستند). هنگامی که اسید مایکولیک با رنگ‌ها ترکیب می‌شود، یک اثر خاص به نام Acid-fastness ایجاد می‌شود.
برای بهبود حساسیت نمایش باکتری‌های مایکوباکتریال، Hagemann (1937) استفاده از رنگ‌های فلورسنت را معرفی کرد و Truant، Brett و Thomas در سال 1962 اهمیت استفاده از رنگ‌های فلورسنت برای باسیل‌های اسید-فست را آنالیز کرده و بازده بالاتر این روش را در نمایش تعداد بالای باسیل‌های اسید فست مثبت نشان دادند. این تکنیک بهتر از تکنیک رنگ آمیزی Ziehl Neelsen بود.
ترکیبی از اورامین و رودامین نتایج رضایت بخشی را در مقایسه با استفاده از این رنگ‌ها به طور جداگانه ایجاد می‌کند. همچنین مشخص شده که این کمپلکس در مقایسه با رنگ آمیزی اسید فست سریعتر است.
اورامین و رودامین هر دو رنگ‌های فلورسنت با میل ترکیبی بالا با اسید مایکولیک موجود در دیواره سلولی گونه‌های مایکوباکتریوم هستند، از این رو دیواره سلولی را زیر یک میکروسکوپ فلورسنت با زمینه سبز، به رنگ زرد یا نارنجی روشن نشان می‌دهد. همچنین می‌توانند انگل‌ها را با اسپروزوآ (Sporozoa) رنگ آمیزی کنند.

اصول رنگ آمیزی اورامین-رودامین

رنگ فلوئوروکروم (Fluorochrome) اورامین-رودامین مورد استفاده، با اسید مایکولیک روی دیواره سلولی باکتری ترکیب می‌شود، که سپس با حرارت بخار تثبیت می‌شود. الکل اسیدی یک عامل رنگ‌زدا است که برای شستشوی رنگ‌ها استفاده می‌شود. رنگ ثانویه پرمنگنات پتاسیم (Potassium Permanganate) برای رنگ آمیزی بافت‌های غیر فلورسنت و بقایای سلولی به کار می‌رود و در نتیجه احتمال ایجاد مصنوعات (Artifact، چیزی که در یک تحقیق یا آزمایش علمی به طور طبیعی وجود ندارد، اما در نتیجه یک روش آماده‌سازی یا تحقیق رخ می‌دهد.) را کاهش می‌دهد. هنگامی که سلول‌ها تحت نور فرابنفش مشاهده می‌شوند، به رنگ زرد-سبز یا قرمز-نارنجی روشن ظاهر می‌شوند.

توجه: برخلاف روش رنگ آمیزی Ziehl Neelsen، هیچ تثبیت حرارتی برای رنگ‌های فلورسانس (رنگ اولیه) انجام نمی‌شود. این امر به این دلیل است که رنگ‌های فلورسنت میل ترکیبی بالایی با اسید مایکولیک روی سلول باکتری دارند، بنابراین بدون اعمال گرما به شدت به هم متصل می‌شوند.

شناساگرها

رنگ‌های اورامین-رودامین (رنگ اولیه)
آب مقطر
اسید-الکل (رنگ‌زدا)
پرمنگنات پتاسیم (رنگ ثانویه)

روش رنگ آمیزی اورامین-رودامین

اسمیر نازکی از نمونه روی یک لام شیشه‌ای میکروسکوپی استریل را تهیه کنید و به آرامی اسمیر را با جهت تثبیت حرارت دهید اما بیش از حد حرارت ندهید.
به مقدار کافی از رنگ‌های اورامین رودامین را روی اسمیر اضافه کنید و اجازه دهید به مدت 15 دقیقه بماند و مطمئن شوید که رنگ‌ها به خوبی اسمیر را رنگ‌ می‌کنند. همچنین حرارت اعمال نکنید.
اسمیر رنگ‌شده را با آب بشویید تا زمانی که رنگی در پساب ظاهر نشود. مطمئن شوید که آب بدون کلر و یا آب مقطر است زیرا کلر با فلورسانس تداخل می‌کند.
عامل رنگ‌زدا (اسید الکل) را اضافه کنید و بگذارید به مدت 2 تا 3 دقیقه بماند تا رنگ‌زدایی انجام شود. سپس با آب مقطر کاملاً بشویید و با تکان دادن اسلاید، آب اضافی را خارج کنید.
اسمیرها را دقیقاً به مدت 2 دقیقه با پرمنگنات پتاسیم (رنگ ثانویه) بپوشانید. توجه: دوره‌های طولانی رنگ آمیزی ثانویه می‌تواند فلورسانس باسیل‌ها را از بین ببرد.
آن را با آب مقطر کاملاً بشویید و اجازه دهید در هوا خشک شود. توجه کنید که با استفاده از یک ماده جاذب، آن را خشک نکنید.
لام را زیر میکروسکوپ فلورسنت با فیلترهای Excitation filter K530 و barrier filter BG12 یا Excitation filter G-362 و barrier filter LP 420 یا با میکرسکوپ نوری با روغن ایمرسیون (Immersion) با بزرگ‌نمایی 400X، برای تأیید حضور باکتری‌های اسید فست بررسی کنید.

نتیجه و تفسیر رنگ آمیزی اورامین-رودامین

تست مثبت: باسیل‌های اسید فست رنگ فلورسنت قرمز-نارنجی یا فلورسنت زرد یا زرد متمایل به قرمز در پس زمینه تیره فلورسانس می‌کنند.

تست منفی: باسیل‌های غیر اسید فست فلورسانس نمی‌کنند و زرد کم‌رنگ به نظر می‌رسند.

کاربردهای رنگ آمیزی اورامین-رودامین

به عنوان یک تست حساس و سریع، برای شناسایی و نشان دادن فرآیند عمل گونه‌های مایکوباکتریوم در نمونه‌های خلط و ادرار استفاده شده است.
همچنین رنگ آمیزی اورامین-رودامین به عنوان یک تست حساسیت برای شناسایی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس (Mycobacterium tuberculosis) و مایکوباکتریوم لپره (Mycobacterium leprae) استفاده می‌شود.

مزایای رنگ آمیزی اورامین-رودامین

این روش یک تکنیک رنگ آمیزی سریع در مقایسه با تکنیک Ziehl-Neelsen است.
حساسیت آن از روش رنگ آمیزی Zeihl-Neelsen بیشتر است.
برای تثبیت رنگ‌ها به حرارت نیاز ندارد.

محدودیت‌های رنگ آمیزی اورامین-رودامین

تایید شناسایی با روش‌های کشت مورد نیاز است زیرا رنگ آمیزی مثبت یا منفی نتایج احتمالی می‌دهد.
اکثر سویه‌هایی که رشد سریعی دارند، ممکن است به صورت فلورسنت ظاهر نشوند.
فلورسانس منفی باید با روش رنگ آمیزی Zeihl Neelsen تایید شود.
این رنگ‌ها (اورامین و رودامین) احتمالا سرطان‌زا هستند.
الکل اسیدی و پرمنگنات پتاسیم می‌توانند سبب سوزش پوست، چشم‌ها و مجاری تنفسی شوند.
قرار گرفتن بیش از حد در برابر رنگ ثانویه ممکن است منجر به از بین رفتن تابش فلورسنت ارگانیسم شود.
رنگ‌ها باید در عرض 24 ساعت پس از رنگ آمیزی و قبل از محو شدن فلورسنس بررسی شوند.

همچنین بخوانید:

منبع

مترجم: صادق حسینی‌کیا

از این مطلب چقدر راضی بودید؟

روی ستاره کلیک کنید تا نظرتون ثبت بشه