مقدمه‌ای بر رنگ آمیزی سلول بطور اختصاصی برای تشخیص تمایز
رنگ آمیزی های اختصاصی سلولی یک روش کارآمد در تشخیص تغییرات سلول از نظر عملکرد، تولید بیومولکولی، شکل و ساختار می باشد. این تست ها می تواند به دو شکل استفاده از رنگ هایی با شناسایی و اتصال اختصاصی و همچنین تشخیص با آنتی بادی استفاده کرد.
رنگ آمیزی سلول با اهداف مختلف مختلفی مانند شناسایی سلول های زنده و مرده، تشخیص مارکر های سلولی برای تمایز، بررسی ساختار، شکست اسید های نوکلئیک و … انجام می شود.
زمانی که تمایز در سلول های تحت کشت اتفاق می افتد در اکثر موارد مشخصه های ژنوتیپی ثابت باقی مانده و مشخصه های فنوتیپی تغییر می کند. به عبارتی سلول بنیادی از نظر عملکرد خام بوده و از منظر بیان ژن، برای ژن های عملکردی بافت های مختلف رویه مشخصی ندارد. همه این ژن ها هنوز از نظر اپی‌ژنتیکی قفل نشده و امکان بیان دارند.
زمانی که تمایز اتفاق می افتد بسیاری از بخش های تواتر ژنی قفل شده و بخش های به شکل فعال بیان می شوند. این افزایش بیان باعث تغییرات بزرگ در سلول از نظر عملکرد، شکل، ساختار و … می شود. لذا با شناسایی تغییرات به وجود آمده پس از تمایز، می توان ترتیبی داد تا یک رنگ به شکل اختصاصی آن تغییر را تشخیص داده و عیان نماید.
یا همچنین می توان از آنتی بادی هایی استفاده نمود که به مارکر های بوجود آمده در اثر آن تغییر و تمایز متصل می شوند. یکی از روش های تشخیص بر پایه آنزیم های تخصصی بافت ها می باشد. سلول ها طبیعتاً برای کسب عملکرد ویژه نیاز به آنزیم های اختصاصی آن عملکرد هستند.
اگر تستی طراحی شود که طی آن یک سوبسترا در اختیار آنزیم باشد و آن آنزیم با تأثیر بر آن سوبسترا یک محصول رنگی تولید کند، می توان از طریق تشخیص کینتیک آن آنزیم، میزان تمایز را مشخص کرد.
رنگ آمیزی آلیزارین رد (Alizarin Red S)
آلیزارین رد یک ترکیب قرمز-قهوه‌ای می باشد که در بافت شناسی و زیست سلولی به عنوان رنگ اختصاصی رنگ آمیزی سلول ها استفاده می شود. در رنگ آمیزی سلول، آلیزارین رد به رسوبات کلسیم متصل می شود. یعنی در بافت هایی مثل استخوان، غضروف و دندان که مسیر معدنی شدن (Mineralization) را در پیش می گیرند این رنگ آمیزی سلول انجام شده و تجمع رنگ آلیزارین رد مورد بررسی قرار می گیرد.
در رنگ آمیزی سلول به روش آلیزارین رد، این رنگ به تجمعات کلسیمی متصل شده و به شکل دانه های نارنجی-قرمز زیر میکروسکوپ دیده می شود. در بررسی تمایز سلول های بنیادی به استخوان، این رنگ آمیزی سلول یک روش کارآمد است که میزان معدنی شدن استئوبلاست ها را نشان می دهد.
در رنگ آمیزی سلول به روش آلیزارین رد، ابتدا سلول ها فیکس شده و سپس برای مدت مشخصی در معرض رنگ قرار می گیرند. پس از آن که رنگ به خوبی به سلول ها نفوذ کرد، چندین بار شسته شده و زیر میکروسکوپ مورد بررسی قرار می گیرد.
در برخی موارد برای کمی سازی نتایج، در انتهای کار و پس از بررسی میکروسکوپی، محلول ایزوپروپانول به چاهک ها اضافه می شود که سلول ها شکسته شده و بلور های آلیزارین رد در ایزوپروپانول حل شود. سپس جذب نوری آن خوانش می شود.
سنجش کینتیک آنزیم آلکالین فسفاتاز
سنجش عملکرد آنزیم آلکالین فسفاتاز (ALP) یکی دیگر از روش های کارآمد بررسی تمایز سلول به استئوبلاست می باشد. اگر در مسیر ترنسکریپتوم از ژن تا عملکرد پروتئین حرکت کنیم، عوامل متعددی را در بیان ژن، ساخته شدن پروتئین، فولدینگ و عملکرد آن می تواند مؤثر باشد. اما به آن چه که در نهایت این مسیر پر پیچ و خم می خواهد برسد، عملکرد پروتئین می باشد.
لذا سنگر آخر تشخیص یک تغییر، بررسی عملکرد و سرعت آن پروتئین در کاتالیز یک فرآیند می باشد. از این رو کیت های زیادی برای سنجش سرعت عملکرد آنزیم ها به شکل تجاری ساخته و عرضه شده است. این کیت ها عموماً دارای Reagent های مختلفی هستند که محلول های اولیه آنزیم را پایدار کرده و سپس در محلول های ثانویه یک سوبسترای مشخصی را در اختیار آنزیم قرار می دهند.
سوبسترا توسط آنزیم شکسته شده و به یک محصول مشخص تبدیل می شود. این محصول تولید شده به گونه‌ای طراحی شده تا پس از ساخته شدن در طول موج مشخصی جذب نوری داشته باشد. یعنی سوبسترا یک ماده بی رنگ و بدون جذب می باشد. اما محصول تولید شده یک ترکیب رنگی با جذب نوری مشخص می باشد. لذا با گذر زمان آنزیم محصولات زیادی را تولید کرده و جذب نوری چاهک افزایش پیدا می کند.
تست های کینتیک در بازه های زمانی مختلف مثلا هر 1 دقیقه خوانش شده و بر اساس مقدار تولید شده محصول توسط آنزیم مورد نظر، km و مقدار آنزیم تشخیص داده می شود.
رنگ آمیزی پریودیک اسید-شیف
پریودیک اسید-شیف (Periodic Acid-Schiff Stain یا PAS Stain) یک روش رنگ آمیزی رایج در بیوشیمی، زیست سلولی و هیستولوژی می باشد. این رنگ آمیزی سلول یا بافت برای تشخیص و تصویربرداری پلیمر های کربوهیدرات استفاده می‌شود. این روش مخصوصاً در تحقیقات مرتبط با تشخیص و مطالعه بیماری‌های مختلف، به ویژه اختلالات گلیکوکالیک که در آن متابولیسم کربوهیدرات مختلف در سلول‌ها دستخوش تغییرات می‌شود، بسیار مفید است.
در روند تمایزی بسیاری از سلول ها ذخیره سازی انرژی از نوع پلیمر های کربوهیدراتی مانند گلیکوژن اتفاق می افتد. یعنی سلول بنیادی ممکن است ذخیره سازی بالایی از انرژی نداشته باشد اما وقتی در روند تمایز سلولی مانند تمایز به کراتینوسیت قرار می گیرد، مقادیر زیادی از گلیکوژن را در داخل سلول ذخیره می کند.
برای بررسی های تخصصی تمایز سلول بنیادی به کراتینوسیت از رنگ آمیزی سلول با آنتی بادی های اختصاصی مانند CK14 استفاده می شود. اما در بسیاری از موارد تهیه آنتی بادی بسیار دشوار است.
لذا با رنگ آمیزی سلول به روش PAS می توان به شکل نسبی تمایز سلول ها به کراتینوسیت را تشخیص داد. چرا که یکی از اهداف رنگ آمیزی سلول به روش PAS، رنگ پذیری بالای گلیکوژن های سلولی است. لذا با این روش رنگ آمیزی سلول می توان مقدار تمایز را مشخص نمود.
در این روش رنگ آمیزی سلول، ابتدا پریودیک اسید با کربوهیدرات هایی مانند گلیکوژن وارد واکنش شده و آن ها را اکسید می کند. پس از شست و شو و حذف پریودیک اسید، عامل شیف کربوهیدرات های اکسید شده را رنگ کرده و آن ها را به رنگ آبی تیره در می آورد.
همچنین برای تشخیص محل حضور سلول ها ی توان از رنگ های زمینه‌ای مثل هماتوکسیلین استفاده کرد. در نهایت پس از اتمام رنگ آمیزی سلول به روش PAS، نمونه زیر میکروسکوپ بررسی می شود.
همچنین بخوانید:
- بررسی زنده مانی سلول ها به کمک رنگ آمیزی AO / PI
- رنگ آمیزی سلول ها با رنگ های هوچست Hoechst و DAPI
- تمایز سلولی چیست؟ نحوه انجام تمایز سلولی
- استخراج سلول های بنیادی از بافت
- کارآموزی مهندسی بافت و پزشکی بازساختی
نویسنده: مسعود سلطانی حلوائی
با سلام. ایا رنگ امیزی سلول در تمایز انها به سلول های استخوانی، به روش تری کروم ماسون، توجیه علمی دارد و امکان پذیر است؟ با سپاس
اگرچه رنگ‌آمیزی تری‌کروم ماسون می‌تواند اطلاعات مفیدی درباره وجود کلاژن در بافت‌ها ارائه دهد، اما برای بررسی تمایز سلولی به سلول‌های استخوانی به طور خاص، تکنیک‌های دیگری که مستقیماً تشکیل مینرال‌ها و ماتریکس استخوانی را نشان دهند، اغلب کاربردی‌تر هستند. توجیه علمی برای استفاده از ماسون تری‌کروم در این زمینه ممکن است بیشتر به خاطر ارتباطات تکمیلی و نه به عنوان روش اصلی باشد.