ویدیو های آموزشی, ژنتیک مولکولی
سنتز cDNA: روش کار و انواع پرایمر
مقدمه‌ای بر سنتز cDNA
به منظور ارزیابی میزان بیان ژنها، لازم است ابتدا RNA های یک سلول استخراج شود تا از روی آن‌ها به کمک آنزیم Reverse Transcriptase یک مولکول DNA مکمل یا همان (Complementary DNA) که موسوم به cDNA است، ساخته شود. آنزیم Reverse Transcriptase نوعی پلیمراز وابسته به RNA است که همانند تمام پلیمراز های دیگر برای ساخت DNA علاوه بر dNTP ها به یک پرایمر کوتاه نیاز دارد. پس از ساخت cDNA امکان آنالیز کمی میزان بیان ژن مربوطه توسط واکنش های Real-Time PCR فراهم میگردد.
در سنتز cDNA از سه نوع پرایمر می توان استفاده کرد:
- Oligo(dt)
- Random hexamer
- اختصاصی
از پرایمر Oligo(dt) جهت سنتز cDNA از روی mRNA استفاده می شود. این پرایمر به دلیل داشتن توالی غنی از نوکلئوتید تیمین و در نتیجه مکمل بودن با انتهای رشتهی mRNA، به دم پلی A انتهای mRNA متصل می شود.
از پرایمر Random hexamer جهت سنتز cDNA از روی mRNA و دیگر RNA های استخراج شده استفاده میشود. این پرایمر به صورت توالی های 6 نوکلئوتیدی تصادفی طراحی شده که به صورت تصادفی به نقاط مختلف RNA متصل می شود.
جهت سنتز cDNA برای دیگر RNAها مانند microRNA از پرایمرهای اختصاصی مانند stem-loop استفاده میشود. به دلیل قابلیت ایجاد یک ساختار سنجاق سری یا hairpin باعث اتصال و شناسایی اختصاصی microRNA ها میشود.
روش کار:
نمونه های RNA آماده شده و داخل تیوب ریخته می شوند و بر اساس نام نمونه ها لیبل می گردند. باید دقت شود آبی که RNA حل شده است فاقد RNAase باشد. مقدار مناسب از پرایمر به هر تیوب اضافه می شود. نمونه ها اسپین شده و به دستگاه ترمال سایکلر منتقل می گردند. دستگاه روی 65 درجه سانتی گراد تنظیم شده و نمونه ها به مدت 5 دقیقه درون ترمال سایکلر انکوبه می شوند. اینکار جهت از بین بردن ساختار ثانویه RNA شده و رشته را کامل باز می کند. پس از اتمام انکوباسیون نمونه ها بر روی یخ به مدت یک دقیقه قرار داده می شوند.
در ادامه به هر نمونه، مقدار مناسب مسترمیکس اضافه شده و اسپین میگردند. در نهایت نمونه ها با سرعت به دستگاه ترمال سایکلر منتقل گردیده و برنامه Geneall بر روی دستگاه اجرا می شود. در برنامه Geneall نمونه به ترتیب در سه دمای مختلف قرار می گیرد. دمای اول که 55 درجه سانتی گراد است، جهت اتصال پرایمر، سپس اتصال آنزیم و سنتز cDNA می باشد. دمای دوم که 85 درجه سانتی گراد است، جهت غیر فعال کردن آنزیم بوده و دمای سوم جهت خنک کردن نمونه می باشد. پس از اتمام واکنش، نمونه ها به فریز منفی 20 درجه سانتی گراد متقل شده و در آنجا نگهداری می شوند.
درspecific primer,ازپرایمر فوراورد استفاده میشه یا ریورز؟
در یک specific primer، هم پرایمر فوروارد و هم ریورس معمولاً با هم استفاده می‌شوند. انتخاب اینکه کدام پرایمر استفاده شود یا هر دو، به نوع آزمایش و هدف شما بستگی دارد.
سلام cdna داخل فریزر منفی ۲۰ چقدر دوام داره؟
تا یک سال هم باقی می مونه ولی درنظر بگیرین که روز به روز کیفیتش کمتر می شه برای نگه داشتن طولانی تر از فریزر منفی 70 هم می تونین استفاده کنین.
مقدار الگوی RNA که برای سنتز cdna استفاده میشود بر چه اساسی تعیین میگردد?
با سلام براساس میزان غلظت RNA که با دستگاه نانودراپ اندازه گیری شده است وزنی یه عنوان Cutoff بنا به پیش نهاد کیت سنتز cDNA انتخاب می شود.
برای سنتز دنا آیا به آنزیمی که بتواند پیوند هیدروژنی بین بازهای مکمل را بشکند نیاز داریم؟
سلام خیر در PCR که روشی به منظور تکثیر DNA می باشد از حرارت بالای 90 درجه برای باز شدن پیوند های هیدروژنی استفاده می شود
سلام وقت بخیر. در سنتز cDNA چه زمانی از specific primer استفاده میکنیم؟
سلام، زمانی که امکان استفاده از پرایمر های non-specific نباشد یعنی، ژن مورد نظر ما آنقدر کوچک باشد که امکان سنتز آن با پرایمرهای non-specific نباشد.
سلام بعد از فرایند سنتز cDNA رشتهDNaی سنتز ده تک رشته هست یا دورشته؟
اگرتک رشته هست برای سنتز رشته دوم چکار باید کنیم؟
سلام نیازی نیست. تک رشته ای است.
سلام چرا از همون اول دی ان ای استخراج نشد و از روی RNA ساختیمش؟؟
سلام، به هدف سنجش بیان ژن ابتدا باید RNA استخراج شود.
گفتید از سه پرایمر میشه استفاده کرد خب در نهایت از چه پرایمری استفاده شد؟
دوتا پرایمر رندوم هگزارمر و اولیگو دی تی استفاده میشود که از جفتش همزمان استفاده کردیم.
سلام.
اطلاعات و ویدئوهایی که تهیه نموده اید، بسیار کاربردی، دقیق و موجز است وبنده با درنظر گرفتن سالها کار و تلاش در مراکز تحقیقاتی و دانشگاه های مختلف، بازهم بعضی مواقع به سایت شما مراجعه میکنم و اطلاعاتم را به روز میکنم.
کاش میتوانستم گوشه ای از محبت ها و زحمات بی دریغ مجموعه شما را جبران کنم.
ارادتمند
سلام دوست عزیز. خوشحال هستیم که توانستیم به شما کمکی کرده باشیم. ممنون از نظر شما.